E-cadherin通過Notch信號(hào)通路介導(dǎo)前列腺癌耐藥的分子機(jī)制.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分進(jìn)行論述：
　　第一部分:紫杉醇誘導(dǎo)的前列腺癌耐藥細(xì)胞株EMT特征分析
　　目的:
　　通過與親本前列腺腫瘤細(xì)胞PC3，DU145相比較，證實(shí)其耐藥細(xì)胞株P(guān)C3-TxR，DU145-TxR中是否有EMT發(fā)生。
　　方法:
　　1.倒置顯微鏡下觀查對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本腫瘤細(xì)胞PC3，DU145及其耐藥細(xì)胞PC3-TxR，DU145-TxR之間的形態(tài)差異，并拍照;
　　2.應(yīng)用RT-PCR，

2、Real-time PCR, Western-blot等方法檢測(cè)已知的EMT相關(guān)標(biāo)記物E-cadherin，N-cadherin，Vimentin等在親本腫瘤細(xì)胞PC3，DU145及其耐藥細(xì)胞PC3-TxR，DU145-TxR之間的表達(dá)差異;
　　3.采用劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親本細(xì)胞PC3，DU145及其耐藥細(xì)胞PC3-TxR，DU145-TxR之間遷移和侵襲能力差異;
　　4.通過采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)

3、，構(gòu)建熒光素酶轉(zhuǎn)染的親本PC3，DU145細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞PC3-TxR，DU145-TxR，構(gòu)建成功以后，皮下注射到6周齡雄性SCID小鼠體內(nèi)，隨時(shí)觀測(cè)成瘤情況，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)小鼠體內(nèi)成瘤能力差異;
　　結(jié)果:
　　1.和親本PC3，DU145細(xì)胞相比較，耐藥細(xì)胞PC3-TxR，DU145-TxR形態(tài)狹長(zhǎng)、呈梭形，細(xì)胞之間更為疏散，呈間充質(zhì)樣形態(tài)改變;
　　2.與親本PC3，DU145細(xì)胞相比較，耐藥細(xì)胞PC

4、3-TxR，DU145-TxR中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)，同時(shí)Vimentin，Snail，N-cadherin表達(dá)上調(diào);
　　3.DU145細(xì)胞24小時(shí)的細(xì)胞遷移率為15.9±3.20％，DU145-TxR細(xì)胞24小時(shí)的細(xì)胞遷移率為68.6±2.85％，DU145-TxR細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)于其親本細(xì)胞DU145(P＜0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示PC3-TxR細(xì)胞24小時(shí)的侵襲和遷移能力明顯強(qiáng)于親本PC3細(xì)胞(P＜

5、0.01);同樣DU145-TxR細(xì)胞24小時(shí)的侵襲和遷移能力也強(qiáng)于親本DU145細(xì)胞(P＜0.01);
　　4.成功構(gòu)建熒光素酶轉(zhuǎn)染的四種細(xì)胞株:PC3-luc，PC3-TxR-luc，DU145-luc，DU145-TxR-luc，熒光酶活性指數(shù)分別為:3.70×107，9.30×107，2.90×107，4.22×107;PC3-TxR-luc細(xì)胞腫瘤體積明顯大于PC3-luc細(xì)胞(P＜0.01);
　　結(jié)論:

6、　　與親本前列腺腫瘤細(xì)胞相比較，耐藥細(xì)胞確實(shí)有EMT現(xiàn)象;并且耐藥細(xì)胞的遷移，侵襲以及體內(nèi)成瘤能力均強(qiáng)于親本細(xì)胞。
　　第二部分 E-cadherin對(duì)前列腺癌細(xì)胞耐藥性以及遷移、侵襲、克隆形成能力的影響
　　目的:
　　構(gòu)建E-cadherin沉默/過表達(dá)的細(xì)胞及其空載對(duì)照細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)構(gòu)建成功細(xì)胞和其親本細(xì)胞之間細(xì)胞功能學(xué)及形態(tài)學(xué)之間的差異以及對(duì)紫杉醇敏感性的差異，探索EMT在前列腺腫瘤耐藥機(jī)制中的作用。
　

7、　方法:
　　1.應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建E-cadherin過表達(dá)的前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞PC3-TxR-E-cadherin，DU145-TxR-E-cadherin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以及空載對(duì)照細(xì)胞株P(guān)C3-TxR-control，DU145-TxR-control，病毒液轉(zhuǎn)染48小時(shí)以后，加入嘌呤霉素篩選直至陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡。Real-time PCR，Western-blot檢測(cè)E-cadherin表達(dá)，同時(shí)Western

8、-blot檢測(cè)和EMT相關(guān)的標(biāo)記物以及和EMT相關(guān)的信號(hào)通路的表達(dá)。
　　2.劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)E-cadherin過表達(dá)細(xì)胞株和空載細(xì)胞株以及親本耐藥細(xì)胞株之間遷移，侵襲能力的差異，MTS法檢測(cè)E-cadherin過表達(dá)細(xì)胞株和空載細(xì)胞株以及親本耐藥細(xì)胞株對(duì)紫杉醇敏感度的差異。
　　3.應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，構(gòu)建E-cadherin瞬時(shí)沉默的的前列腺腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞株P(guān)C3-si-E-cadheri

9、n，DU145-si-E-cadherin以及空載對(duì)照細(xì)胞株P(guān)C3-si-control，DU145-si-control，轉(zhuǎn)染48小時(shí)以后，提取mRNA及蛋白，然后Real-time PCR，Western-blot檢測(cè)E-cadherin表達(dá)，同時(shí)Real-timePCR檢測(cè)和EMT相關(guān)的標(biāo)記物以及和Notch-1信號(hào)通路的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建E-cadherin過表達(dá)的前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞PC3-TxR-

10、E-cadherin，DU145-TxR-E-cadherin穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株以及空載對(duì)照細(xì)胞株P(guān)C3-TxR-control,DU145-TxR-control，和親本細(xì)胞相比較 PC3-TxR-E-cadherin, DU145-TxR-E-cadherin中E-cadherin表達(dá)明顯升高，同時(shí)PC3-TxR-control, DU145-TxR-control和親本細(xì)胞相比較E-cadherin表達(dá)無變化;過表達(dá)細(xì)胞株中Vimen

11、tin, Claudin-1表達(dá)降低，Notch-1信號(hào)通路蛋白的表達(dá)明顯降低。
　　2.細(xì)胞36小時(shí)的細(xì)胞遷移率依次為:DU145-TxR,68.8±2.86％;DU145-TxR-control,66.6±2.88％; DU145-TxR-E-cadherin,38.3±1.63％;DU145-TxR細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)于E-cadherin過表達(dá)細(xì)胞DU145-TxR-E-cadherin(P＜0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)

12、顯示和親本耐藥細(xì)胞相比較E-cadherin過表達(dá)細(xì)胞24小時(shí)的侵襲和遷移能力都明顯降低(P＜0.01);MTS結(jié)果顯示72小時(shí)IC50依次為PC3-TxR,146.81±1.46nmol/L; PC3-TxR-control,139.13±4.60nmol/L; PC3-TxR-E-cadherin,96.2±15.03nmol/L; DU145-TxR,3831.9±65.69nmlo/L; DU145-TxR-control,37

13、25.45±87.36nmol/L; DU145-TxR-E-cadherin,3022.10±34.01 nmol/L。在兩種不同的E-cadherin過表達(dá)前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞中，對(duì)紫杉醇的敏感性均強(qiáng)于其親本耐藥細(xì)胞(P＜0.05)。
　　3.和親本細(xì)胞相比較PC3-si-E-cadherin, DU145-si-E-cadherin中E-cadherin表達(dá)降低，同時(shí)PC3-si-control, DU145-si-contr

14、ol和親本細(xì)胞相比較E-cadherin表達(dá)無變化;PC3-si-E-cadherin, DU145-si-E-cadherin細(xì)胞中Vimentin, Snail表達(dá)升高，Notch-1信號(hào)通路的表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　E-cadherin和前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞的EMT發(fā)生密切相關(guān)，并影響前列腺腫瘤細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移以及克隆形成能力并且和紫杉醇耐藥性密切相關(guān)。
　　第三部分 Notch-1信號(hào)通路在EMT

15、所介導(dǎo)的前列腺癌耐藥機(jī)制中的作用
　　目的:
　　研究Notch-1信號(hào)通路在前列腺腫瘤細(xì)胞和EMT之間的關(guān)系以及在耐藥機(jī)制中的作用。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)在檢測(cè)E-cadherin過表達(dá)的前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞株中Notch-1的表達(dá)，以及在E-cadherin沉默后的前列腺腫瘤細(xì)胞中的Notch-1的表達(dá);
　　2.應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)γ-分泌酶的特異性抑制

16、劑(GSI)在不同濃度不同時(shí)間對(duì)前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞中Notch家族成員的抑制效率;
　　3.MTS檢測(cè)GSI和紫杉醇聯(lián)合給藥對(duì)前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞的紫杉醇耐受性是否有所恢復(fù);
　　結(jié)果:
　　1.在E-cadherin過表達(dá)的前列腺腫瘤耐藥細(xì)胞株中Notch-1表達(dá)下調(diào)在E-cadherin沉默后的前列腺腫瘤親本細(xì)胞中Notch-1表達(dá)上調(diào);
　　2.GSI在20μmol/L，72小時(shí)的時(shí)候明顯抑制PC3-TxR,

17、 DU145-TxR細(xì)胞中Notch-1的表達(dá);20μmol/L，24小時(shí)的時(shí)候明顯抑制PC3-TxR,DU145-TxR細(xì)胞中Notch-4的表達(dá);
　　3.紫杉醇和GSI(20μmol/L)聯(lián)合給藥72小時(shí)的IC50依次為:PC3-TxR+GSI=13.9±1.59nmol/L, DU145-TxR+GSI=838.0±134.4nmol/L;而紫杉醇單獨(dú)給藥72小時(shí)IC50依次為:PC3-TxR=191.2±11.9nmol