維生素D預防潰瘍性結腸炎復發(fā)的作用與機制研究.pdf

1、潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)是一種病因不明的腸道慢性炎癥性疾病,近年來在我國近年呈高發(fā)趨勢,高復發(fā)率是其突出特征。然而,由于基本機制不明,目前UC治療的根本目標仍然是控制癥狀,誘導緩解。如何更有效的防治UC復發(fā)是臨床亟待解決的問題。
　　 近年UC發(fā)病機制的研究進展,給治療學提供了新的啟示。目前關于UC發(fā)病機制的基本共識是:易感個體在環(huán)境因素作用下,腸黏膜屏障削弱,腸道致病菌群及其有害成分穿過黏膜屏

2、障,和有缺陷的免疫系統(tǒng)相接觸,引發(fā)局部炎癥反應,細菌不能被及時清除,使病情遷延反復。人體腸道處于復雜的帶菌環(huán)境,腸黏膜表面積約有300m2,腸道內(nèi)大約有500種共生菌,每克結腸內(nèi)容物含有多達1012株共生菌,而易感個體腸黏膜屏障通透性顯著升高,使細菌通過腸黏膜屏障的機會增加,由此可見,對于已經(jīng)有遺傳缺陷的個體,及時清除黏附于腸壁表面和偶然突破腸黏膜屏障的致病菌是防止疾病發(fā)生和復發(fā)的關鍵。
　　 抗菌肽在維持腸道黏膜屏障不被細菌入

3、侵中起決定作用。它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的殺菌劑,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、病毒和原蟲均具有殺菌作用。防御素是人體腸道最主要的抗菌肽,結腸細胞主要表達防御素-1(humanβ-defensin1,HBD-1)和防御素-2(humanβ-defensin2,HBD-2)。
　　 研究表明,維生素D在調控防御素表達中起關鍵作用,流行病學調查發(fā)現(xiàn)UC患者普遍存在維生素D缺乏,動物實驗證實維生素D受體基因敲除的小鼠更容易誘導出結腸炎

4、,且結腸炎癥狀因補充活性維生素D獲得緩解。只有活化的維生素D才具有生物學效能,然而活性維生素D即1,25-(OH)2D3循環(huán)濃度僅為0.03～0.06ng/ml,而其發(fā)揮抗菌作用所需生物作用濃度高達循環(huán)濃度數(shù)十甚至上百倍,提示維生素D可能存在一種局部活化形式。2001年Zehnder D證實結腸上皮細胞存在維生素活化的關鍵限速酶-25-羥維生素D1-α-羥化酶(25-Hydroxyvitamin D31-alpha-hydroxylas

5、e,CYP27B1),因而我們推測CYP27B1可能是維生素D對防御素局部調控的關鍵。為此我們進行了如下研究:①收集UC患者和正常人腸黏膜組織標本,檢測CYP27B1、防御素-2(HBD-2)在腸黏膜中的表達及其相關性;②采用過表達策略,構建重組腺病毒載體Ad-CYP27B1并感染Caco-2細胞,觀察高表達CYP27B1對Caco-2細胞HBD-2和HBD-2表達的影響;③對比觀察維生素D聯(lián)合5-氨基水楊酸(5-ASA)與單獨應用5-

6、ASA對緩解期UC病人累積緩解率的影響,評價活性維生素D作為緩解期維持治療藥物的效能。實驗內(nèi)容主要包括以下三部分:
　　 第一部分 CYP27B1在潰瘍性結腸炎腸上皮組織中的表達及其與防御素-1、防御素-2的關系
　　 目的;檢測人類潰瘍性結腸炎患者結腸黏膜中CYP27B1和HBD-1、HBD-2在mRNA和蛋白水平的表達,探討CYP27B1與防御素表達之間的關系,以及其在UC發(fā)病中的作用。
　　 方法:①依據(jù)臨

7、床資料、血液生化指標及內(nèi)鏡表現(xiàn),選擇在河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科診斷明確的活動期UC患者。②免疫組織化學方法檢測UC和正常對照結腸組織中的表達。③real-time Q-PCR方法測定UC患者和正常對照結腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2在轉錄水平的表達。④Western blot檢測UC患者和正常對照結腸上皮CYP27B1、HBD-1和HBD-2蛋白的表達。實驗分組如下:(1)con組:正常結腸黏膜;(2)uninfl組:

8、UC患者非炎癥結腸黏膜;(3)infl組:炎癥結腸黏膜。
　　 結論:OCYP27B1,HBD-1和HBD-2在正常對照組織和非炎癥黏膜組織及炎癥黏膜組織中的表達有顯著差異,其中CYP27B1和HBD-2在UC病變部位顯著高表達,而HBD-1在UC患者正常及病變黏膜均低表達。提示三者可能參與了UC發(fā)病的病理過程;②UC患者病變部位HBD-2表達和CYP27B1的表達呈顯著正相關,而HBD-1和CYP27B1的關聯(lián)有待進一步證實。

9、
　　 第二部分 CYP27B1腺病毒表達載體的構建及其體外促進防御素表達的效應觀察
　　 目的:探討CYP27B1過表達對體外培養(yǎng)的Caco-2細胞HBD-1及HBD-2的調控作用。
　　 方法:①重組腺病毒Ad-CYP27B1的構建:從Caco-2細胞提取RNA,經(jīng)RT-PCR擴增得到目的基因CYP27B1片段,克隆至pTA2克隆載體,將測序正確的CYP27B1亞克隆至pAdTrack-CMV中后轉化含pAd

10、Easy-1的感受態(tài)BJ5183,通過同源重組獲得腺病毒載體質粒,轉染293包裝病毒顆粒;②采用real-time Q-PCR技術和Western blot方法檢測被感染的Caco-2細胞中CYP27B1的mRNA和蛋白表達以證實重組腺病毒Ad-CYP27B1的成功構建;③采用過表達策略,以腺病毒為載體,將Ad-CYP27B1及對照空病毒Ad-GFP轉染體外培養(yǎng)的Caco-2細胞,分別采用real-time Q-PCR技術及Wester

11、n blot檢測Caco-2細胞中HBD-1及HBD-2在mRNA、蛋白表達水平的變化。實驗分組如下:(1)con組,以含10％胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞,在感染步驟加入無血清無抗生素DMEM代替病毒液;(2)Ad-GFP組,感染表達綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空病毒Ad-GFP;(3)Ad-CYP27B1組,感染攜帶CYP27B1基因并表達GFP的重組腺病毒Ad-CYP27B1

12、。
　　 結論:CYP27B1基因促進了HBD-1及HBD-2在Caco-2細胞的mRNA和蛋白表達,從而可能增強結腸上皮的抗菌功能,對維持結腸黏膜屏障功能完整起到保護作用。
　　 第三部分維生素D對潰瘍性結腸炎維持緩解的作用
　　 目的:潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,uc)是臨床常見復發(fā)性疾病,目前尚無滿意的緩解期治療措施,標準治療方案僅能將1年內(nèi)累積復發(fā)率降為50％,研究顯示UC發(fā)病和維

13、生素D缺乏相關聯(lián),本研究的目的是對5-氨基水楊酸方案聯(lián)合維生素D對維持緩解的效果進行前瞻、單盲的隨機對照觀察,探索其做為緩解期維持治療方案的可行性,為UC緩解期治療提供新的思路。
　　 方法:將52例誘導緩解的潰瘍性結腸病人,隨機分為維生素D+美沙拉秦組(26人)和美沙拉秦組(26人),分別給予羅鈣全0.25μg1/日+美沙拉秦500mg3/日或單獨給予美沙拉秦500mg3/日。終點事件為疾病復發(fā)。采用Kaplan-Meier法