EFEMP1表達與子宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其意義.pdf

1、腫瘤組織微血管的新生在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色，隨著臨床新興出現(xiàn)的血管生抑制劑用于臨床腫瘤的治療，有關(guān)腫瘤血管新生相關(guān)因子的分子生物學研究日益受到重視。EFEMP1(epidermal growth factor-containing fibulin-likeextracellular matrix proteins)也叫fibulin-3,屬于fibulin基因家族相對分子質(zhì)量約50×103(kd)蛋白，并被證實是一個與血管新生

2、有關(guān)的細胞外基質(zhì)蛋白。最初發(fā)現(xiàn)它由于存在R345W突變，沉積于視網(wǎng)膜色素上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而刺激VEGF的表達，引起血管的增生從而導致脈絡膜黃斑變性疾病，但它在腫瘤中的作用報道甚少且結(jié)果不一。較早研究結(jié)果顯示，在肺癌組織中，fibulin-3由于啟動子甲基化而導致表達降低，在體外EFEMP1有拮抗腫瘤血管生成作用。隨后有報道提出，EFEMP1作為血管生成拮抗劑，由于基因異常甲基化而低表達于乳腺癌組織中，且這種低表達與患者預后不良有關(guān)。另

3、一方面，有最新的研究表明，EFEMP1的表達在體外促進了胰腺癌的生長和VEGF的表達，導致CD31(+)的微血管數(shù)量增加。鑒于此不相一致的實驗結(jié)果，有學者提出EFEMP1的表達可能因不同組織學起源的腫瘤而發(fā)揮不同的生物學作用。
　　 子宮頸癌是女性高發(fā)高侵襲性的惡性腫瘤，那么在子宮頸癌組織中EFEMP1的表達情況如何以及它與腫瘤的微血管生成的關(guān)系究竟如何?本研究首先通過檢測臨床子宮頸癌組織中的表達情況，探討EFEMP1的表達與子

4、宮頸癌血管生成以及生物學行為的關(guān)系；進而在細胞水平上探討EFEMP1影響子宮頸癌血管生成的可能機制；最后在動物腫瘤模型實驗水平證實EFEMP1對子宮頸癌生長的影響。
　　 第一章子宮頸癌組織中EFEMP1的表達對子宮頸癌微血管形成及生物學行為的影響
　　 目的：探討EFEMP1在子宮頸癌組織中的表達及其與宮頸癌的微血管生成和生物學行為的關(guān)系。
　　 方法：于100例臨床子宮頸癌標本和10例宮頸炎正常上皮對照組織中

5、，采用免疫組化MaxivisionTM方法檢測EFEMP1的表達，并采用原位雜交方法檢測其中VEGF mRNA的表達。用CD34組化標記微血管內(nèi)皮，以計數(shù)各個樣本組織中微血管密度(microvascular density，MVD)。結(jié)合各病例的臨床病理參數(shù)，分析EFEMP1蛋白的表達與宮頸癌生物學行為的關(guān)系，并對EFEMP1表達與VEGFmRNA表達和MVD之間進行相關(guān)性分析，以初步探討EFEMP1與宮頸癌微血管生成的關(guān)系及其可能機制

6、。
　　 結(jié)論：(1)EFEMP1高表達于宮頸癌組織中，并與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤有關(guān)；(2)EFEMP1可能通過上調(diào)宮頸癌VEGF的表達而促進宮頸癌微血管的增生；(3)EFEMP1的高表達與宮頸癌的預后不良有關(guān)，可視為獨立的預后不良因素。
　　 第二章 EFEMP1對子宮頸癌細胞的增殖、侵襲能力、VEGF表達及其對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移和管腔形成能力影響的研究
　　 目的：研究EFEMP1蛋白對子宮頸癌

7、細胞的增殖、侵襲能力、VEGF表達及其對人臍靜脈內(nèi)皮細胞生長、遷移和管腔形成能力的影響
　　 方法：不同濃度人工重組EFEMP1蛋白作用宮頸癌Hela細胞后，MTT法檢測EFEMP1對Hela細胞增殖能力的影響：不同濃度人工重組蛋白EFEMP1蛋白作用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，同時用不同濃度的VEGF因子處理HUVECs做內(nèi)對比，用MTT法檢測兩種作用因素處理后HUVECs生長增殖情況。Transwell小室法檢測EFE

8、MP1對Hela侵襲能力的影響以及對HUVECs遷移能力的影響。采用Rose Bengal活細胞染色法，檢測EFEMP1對Hela細胞與HUVECs之間黏附力的影響。通過Matrigel膠體外內(nèi)皮細胞管腔形成能力實驗，觀察EFEMP1對HUVECs體外管腔形成能力的影響。用陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，通過轉(zhuǎn)染真核表達載體pCMV6質(zhì)粒，將EFEMP1基因瞬時導入宮頸癌Hela細胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞48h，取細胞上清液，采用夾心酶聯(lián)免疫

9、吸附試驗(ELISA)檢測宮頸癌細胞上清液中VEGF表達，以檢測EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對Hela細胞VEGF表達的影響。
　　 結(jié)論：(1)EFEMP1能促進宮頸癌細胞的生長、浸潤和VEGF表達；(2)EFEMP1對內(nèi)皮細胞的生物學功能無直接影響；(3)EFEMP1提高宮頸癌血管生成活性可能是通過其提高宮頸癌VEGF表達水平的途徑實現(xiàn)，而不是通過直接影響內(nèi)皮細胞功能的途徑實現(xiàn)。
　　 第三章 EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對子宮頸癌

10、生長影響的研究
　　 目的：探討EFEMP1基因轉(zhuǎn)染對裸鼠實驗性子宮頸癌的生長的影響。
　　 方法：：通過陽離子脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)染方法，利用真核表達載體pCMV6質(zhì)粒，將EFEMP1基因?qū)雽m頸癌Hela細胞，經(jīng)抗生素G418篩選獲得抗性克隆，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(PR-PCR)檢測轉(zhuǎn)染后宮頸癌細胞中EFEMP1基因的表達，并通過免疫蛋白印跡技術(shù)(western-blot)檢測轉(zhuǎn)染后宮頸癌細胞中EFEMP1蛋白的表達情況，

11、以驗證轉(zhuǎn)染效果。BALB/c雌性裸鼠9只，5～7周，SPF條件飼養(yǎng)，隨機分為3組，每組3只。將轉(zhuǎn)染EFEMP1基因的Hela細胞(Hela-EFEMP1)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體的陰性對照組細胞(Hela-vector)和正常Hela細胞分別接種于3組裸鼠皮下，以構(gòu)建宮頸癌裸鼠荷瘤模型。待成瘤后，隔日觀察3組腫瘤的生長情況，并于接種后的第30天處死裸鼠，稱取腫瘤重量并取材。將各組取下的腫瘤組織固定、包埋、切片，利用免疫組化MaxvisionTM