加壓毛細管電色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺的搭建與應用及細胞代謝組學研究.pdf

1、隨著后基因時代的到來,代謝組學、蛋白組學、脂質(zhì)組學等系統(tǒng)生物學研究已成為國際矚目的研究熱點,樣品量的減少和樣品復雜程度的增加,使得分析科學家們越來越重視分析技術(shù)的微型化及分離效率與靈敏度。
　　加壓毛細管電色譜(pCEC)作為一種新興的微流分析技術(shù),具有電壓和壓力雙重分離機理,以及高柱效、高選擇性、高分辨率、快速分離等特點,在分析復雜生物樣品中獨具優(yōu)勢。質(zhì)譜(MS)是一種被廣泛用于物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析與鑒定的通用型檢測器,具有高靈敏度、高

2、準確性等特點。電噴霧(ESI)接口等軟電離技術(shù)解決了質(zhì)譜與其他分離技術(shù)的在線聯(lián)用,通過這種方式得到的集成系統(tǒng)具有高分辨力、高靈敏度,同時還能提供物質(zhì)分子量和結(jié)構(gòu)信息。
　　本課題將pCEC與MS在線聯(lián)用,擴大pCEC的應用領(lǐng)域,為增加儀器產(chǎn)品的實用性和適用性提供有力的技術(shù)支持。研究中還提出了一種同時提取細胞極性與非極性代謝產(chǎn)物的方法,并采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)開展了細胞代謝組學研究。
　　本論文共分為五章,主要內(nèi)容包括:<

3、br>　　第一章介紹了選題的背景和意義,對加壓毛細管電色譜、肺癌、代謝組學分別進行了綜述。重點闡述了代謝組學研究在疾病分型和標志物研究,尤其是對肺癌早期篩查的重要意義。
　　第二章對pCEC-MS的接口進行設計并對其性能進了系統(tǒng)考察。對比了不同接口方式對分離和檢測的影響,并首次實現(xiàn)了采用無補流型接口實現(xiàn)pCEC與MS聯(lián)用。考察了流速、流動相中鹽離子、毛細管兩端電壓對樣品分離分析的影響,同時對聯(lián)用系統(tǒng)的檢測限和重現(xiàn)性進行考察。實驗證

4、明,所搭建的pCEC-MS聯(lián)用系統(tǒng)操作簡便,信號穩(wěn)定,靈敏度高,樣品檢測限達ng/mL級。
　　第三章應用自行搭建的pCEC-MS系統(tǒng)進行代謝組學分析。采用柱上富集技術(shù),有效提高了樣品的信號響應強度。同時,對pCEC流動相中有機相組成、酸改性劑濃度、操作電壓、洗脫梯度進行優(yōu)化,并對所建立的pCEC-MS對尿的分析方法進行驗證。將肺癌病人與正常人尿樣分別進樣分析,采用PCA和OPLS-DA模型對其進行統(tǒng)計分析,得到候選差異物49個。

5、與正常人對照組相比,肺癌病人在肉毒堿、尿酸和氨基酸代謝通路上發(fā)生不同程度的紊亂。
　　第四章研究了基于高效液相色譜(HPLC)和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的肺癌細胞代謝組學分析。提出了一種同時提取細胞極性與非極性代謝產(chǎn)物的方法,并采用HPLC-MS技術(shù)對7種人肺癌細胞和人正常胚肺成纖維細胞進行分析,通過多元統(tǒng)計分析手段獲得和鑒定出10種極性代謝差異物與21種非極性代謝差異物。與正常細胞相比,肺癌細胞在蛋白質(zhì)代謝、脂肪酸代謝、磷脂代謝發(fā)生不同程度