抗Thy-1腎炎模型基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜研究.pdf

1、背景與目的：
　　 系膜增殖是慢性腎小球腎炎常見的病理表現(xiàn)，由于發(fā)病機(jī)制不清，缺乏有效的治療措施?？筎hy-1腎炎模型是經(jīng)典的系膜增殖性腎炎模型，主要表現(xiàn)為可逆的系膜細(xì)胞增殖。本研究通過(guò)分析抗Thy-1腎炎模型不同時(shí)間點(diǎn)腎臟的基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜，篩選與系膜增殖相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)，為系膜增殖性腎炎的發(fā)病機(jī)制及其干預(yù)措施的研究提供候選基因和干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 材料和方法：
　　 1、模型的制備：200g健康雄性W

2、istar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）和模型組（30只）。對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水，模型組一次性尾靜脈注射抗Thy-1抗體（2.5mg/kg），制備抗Thy-1腎炎模型，分別于0d（對(duì)照組）、3d、5d、7d、10d、14d（均為模型組，分別代表抗體注射后第3、5、7、10、14天）處死大鼠。
　　 2、基因表達(dá)譜分析：提取腎臟皮質(zhì)RNA，利用Affymetrix U2302.0芯片（包含31000個(gè)探針位點(diǎn)，代表28000個(gè)大

3、鼠基因），分析各時(shí)間點(diǎn)大鼠的基因表達(dá)譜。利用SAM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到模型組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較的差異表達(dá)基因；利用Cluster3.0軟件對(duì)差異表達(dá)基因和其中的轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析；利用Gominer軟件和MAS系統(tǒng)分別進(jìn)行基因的生物進(jìn)程和分子功能分析；利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析分子通路變化；用定量PCR對(duì)TIMP-1、CCL2、S100A4、KLF15、MXI1進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 3、蛋白質(zhì)組學(xué)分析：提取大鼠腎小球蛋白質(zhì)

4、，采用Cy2、Cy3、Cy5分別標(biāo)記各樣本。24cm pH3-11 NL strip和12.5％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行雙相分離，利用Decyder軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；從制備膠中切取差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜和液質(zhì)聯(lián)用方法鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。Western blot驗(yàn)證FHL2、NIT2蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、抗Thy-1腎炎模型的病理改變和血、尿檢測(cè)：（1）大鼠腎組織病

5、理改變：模型腎臟在3d時(shí)出現(xiàn)系膜溶解，5d時(shí)出現(xiàn)系膜增殖，7d時(shí)出現(xiàn)重度的系膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，10d系膜增殖開始消退，14d系膜增殖顯著消退。（2）24hr尿蛋白定量：模型組大鼠3d、5d、7d、10d尿蛋白定量顯著高于對(duì)照組，其中3d是高峰；（3）血肌酐和尿素氮：模型組大鼠5d和7d血肌酐和尿素氮顯著高于對(duì)照組，其中7d是高峰。
　　 2、抗Thy-1腎炎模型腎臟基因表達(dá)譜分析：（1）SAM軟件分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組

6、比較，模型組3d、5d、7d、10d、14d的差異表達(dá)基因數(shù)量分別是30、952、494、154、861個(gè)。（2）系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，模型組差異表達(dá)基因的變化趨勢(shì)可以分為5種類型：第1類變化趨勢(shì)：在5d和成7d表達(dá)上調(diào)至高峰，10d和/或14d下調(diào)；第2類變化趨勢(shì)：在5d和/或7d表達(dá)下調(diào)至低點(diǎn)，10d和/或14d上調(diào)；第3類變化趨勢(shì)：在5d和/或7d表達(dá)下調(diào)，10d上調(diào)，14d下調(diào)；第4類變化趨勢(shì)，在5d和/或7d表達(dá)開始下調(diào)，10

7、d和/或14d下調(diào)至最低點(diǎn)；第5類變化趨勢(shì)，在5d和/或7d表達(dá)開始上調(diào)，10d和/或14d上調(diào)至最高峰。在各個(gè)類型中，都有增殖和凋亡相關(guān)的基因差異表達(dá)。（3）GO分析結(jié)果顯示，模型組各時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因主要參與代謝、生物調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激等生物進(jìn)程和催化活性、分子結(jié)合等分子功能。（4）轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因系統(tǒng)聚類分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因表達(dá)變化趨勢(shì)主要集中在以下2類：一類在5d和/或7d上調(diào)至峰值，10d和/或14d表達(dá)下調(diào)，以促凋亡基

8、因和抑增殖基因?yàn)橹鳎涣硪活愒?d和/或7d開始下調(diào)，14d下調(diào)至最低值，以促凋亡基因?yàn)橹鳌＃?）分子通路分析結(jié)果顯示，模型組5d、7d、10d、14d發(fā)生變化的分子通路數(shù)量分別是28、24、9、22條。與細(xì)胞增殖相關(guān)的分子通路主要包括局部粘附、縫隙連接、緊密連接、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、p53信號(hào)通路、細(xì)胞周期、細(xì)胞因子與受體相互作用、細(xì)胞粘附分子、MAPK信號(hào)途徑等。在系膜增殖期，這些通路被激活；在系膜增殖恢復(fù)期，局部粘附、縫隙連接、細(xì)胞周期等

9、通路被抑制。（6）定量PCR檢測(cè)TIMP-1、CCL2、S100A4、KLF15、MXI1基因表達(dá)表達(dá)趨勢(shì)與芯片中的結(jié)果基本一致。
　　 3、抗Thy-1腎炎模型蛋白質(zhì)組學(xué)分析：（1）利用Decyder軟件，在模型組中共發(fā)現(xiàn)了108個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。利用Maldi-Tof-MS和LTQ技術(shù)進(jìn)行鑒定，共鑒定出了40個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與代謝、應(yīng)激、生物調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程和催化活性、分子結(jié)合等分子功能。（2）系統(tǒng)聚

10、類分析結(jié)果顯示：差異表達(dá)蛋白質(zhì)的變化趨勢(shì)主要集中在以下2類：一類是10d和/或14d表達(dá)下調(diào)，包括促增殖和抑增殖蛋白質(zhì)；另一類是10d和/或14d表達(dá)上調(diào)，以抑增殖蛋白質(zhì)為主。（3）驗(yàn)證：用Western blotting驗(yàn)證了FHL2和NIT2蛋白質(zhì)表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 無(wú)論是抗Thy-1腎炎的系膜增殖期還是增殖恢復(fù)期，都有增殖和凋亡相關(guān)的基因差異表達(dá)，其中包括相關(guān)的轉(zhuǎn)錄基因。各