抗Thy1大鼠模型的基因表達譜分析.pdf

1、目的:
　　 系膜增生性腎炎(MsPGN)是我國多種腎小球疾病中最常見的病理類型之一,約占我國腎活檢病人的50％左右,其主要的病理變化是系膜細胞(MC)的增殖和系膜基質(zhì)沉積。免疫炎癥、遺傳等多種因素可導(dǎo)致促進/抑制系膜增殖的平衡紊亂,隨后出現(xiàn)的持續(xù)性系膜增殖和系膜基質(zhì)積聚最終引起不可逆性的腎小球硬化。抑制系膜細胞過度增殖是系膜增生性腎炎的重要治療措施。既往研究多集中于尋找促進系膜細胞增殖的基因,對其進行調(diào)控以達到延緩或防治疾病進

2、展的目的,但其效果并不理想。因此我們以尋求抑制系膜增殖的因子為切入點,探討這部分因子在系膜細胞增殖過程中所起作用。一般認為,MsPGN的進展(系膜細胞增殖)過程中,增殖期內(nèi)促進系膜細胞增殖因子上調(diào)而相拮抗的抑制增殖因子下調(diào)。到恢復(fù)期時,促增殖因子下調(diào)而抑制因子上調(diào)?；谶@一思路,本研究的目的在于尋找可能抑制抗Thy1系膜增生性腎炎大鼠模型中系膜細胞增殖的相關(guān)基因,并對其抑制系膜細胞增殖的功能進行體外驗證。
　　 方法:
　

3、　 培養(yǎng)OX-7雜交瘤細胞株產(chǎn)生抗Thy1抗體,FPLC純化后尾靜脈注射Wistar大鼠制備抗Thy1系膜增生性腎炎大鼠模型,檢測不同時間點(0、3、5、7、10、14天)的腎功能和24h尿蛋白,留取腎組織,分離腎小球并提取總RNA。利用大鼠U2302.0芯片進行掃描,SAM、Gominer軟件分析所得數(shù)據(jù)獲得差異表達基因群及基因功能的分類,重點分析增殖期(5天和7天)內(nèi)與增殖進程相關(guān)的基因群表達情況。熒光定量PCR(Taqman探針

4、法)對部分增殖相關(guān)的差異表達基因(Ratio≥1.50或≤0.67,且Score≥2或≤-2,q-value＜0.05,FDR＜5％)進行驗證,篩選可能抑制系膜細胞增殖的候選基因。同時培養(yǎng)大鼠系膜細胞(RMC),設(shè)計合成抑制KLF15表達的siRNA,利用RNAi技術(shù)敲低RMC中KLF-15(Kruppel-Likefactor15)的表達,并以無關(guān)siRNA為對照,。實驗分組:1)無血清組;2)正常對照組;3)siCon轉(zhuǎn)染組;4)s

5、iKLF轉(zhuǎn)染組。24/48h后,MTT實驗和流式細胞儀技術(shù)分析細胞增殖活性及細胞周期的改變情況,WesternBlot及間接免疫熒光檢測細胞周期蛋白CDK2、CyclinD1、p21的表達變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.純化出的抗Thy1抗體效價高、純度高、特異性好,并利用該抗體制備了抗Thy1系膜增生性腎炎大鼠模型:與對照組大鼠相比,模型組大鼠第5天和第7天腎小球系膜細胞增殖明顯,而10天和14天逐漸降低。24h尿蛋白

6、定量特點為第5天和10天顯著升高(p＜0.05,n=6),而第10天后開始下降;
　　 2.基因芯片共檢測到9033個已知基因,其中至少在一個時間點與對照組相比有差異表達的有1001個基因,已知功能的基因為619個,主要功能為結(jié)合功能、催化功能、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)功能、轉(zhuǎn)運功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能以及酶調(diào)節(jié)等功能。Gominer軟件對其進一步分析表明,增殖期和恢復(fù)期中與細胞增殖進程相關(guān)的差異基因分別為19個(第5天)、21個(第7天)、21個(

7、第10天)、21個(第14天)。這部分基因中,第5天和第7天中出現(xiàn)上調(diào)且可能具有抑制增殖功能的基因有KLF15、Mxi-1等,第5天和第7天出現(xiàn)上調(diào)且具有促進增殖功能的基因有TIMP-1、Ccl-2、S100A4等。熒光定量PCR對這部分基因進行驗證,結(jié)果表明基因的表達變化趨勢與基因芯片檢測結(jié)果一致,皮爾森檢驗相關(guān)系數(shù)(＞0.90,p＜0.05,n=6);
　　 3.與正常組及siCon轉(zhuǎn)染組相比,合成的siRNA可特異抑制篩選

8、出的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因KLF-15的mRNA和蛋白表達水平p＜0.05。MTT檢測結(jié)果表明,siKLF組細胞數(shù)增多,經(jīng)流式細胞儀分析證實,與siCon組相比,處于S期細胞明顯增多,p＜0.05,n=3。免疫印跡及間接免疫熒光檢測結(jié)果表明,與siCon組及正常對照組相比,siKLF組細胞周期相關(guān)蛋白CDK2、cyclinD1及p21的表達均上調(diào)(p＜0.05,n=3)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究利用純化后的純度高、特異性好