原位蛋白質質譜的開發(fā)和應用.pdf

1、常規(guī)的蛋白質質譜依賴于包括高效液相色譜和凝膠電泳在內的其他技術對復雜體系中的蛋白質進行分離純化。一方面，正是這些耗時、離線的分離純化過程嚴重改變了蛋白質的生存環(huán)境，從而導致質譜檢測到的蛋白質并不一定是細胞內蛋白質的真實狀態(tài)。另一方面，這些樣品預處理過程可能會直接導致細胞內低豐度的蛋白質等樣品信息丟失。這些蛋白質卻可能在某些疾病甚至癌癥的發(fā)病過程中扮演著不可或缺的角色。而這是相當危險的，因為很多臨床診斷、醫(yī)學鑒定都是基于這些離線檢測結果。

2、如果這些結果不可靠，就可能直接誤導醫(yī)生對疾病的診斷、治療方案的選擇等方面的判斷。綜上所述，開發(fā)能夠對細胞內的蛋白質相互作用進行直接、快速分析的原位蛋白質質譜方法，無論是從基礎理論研究的角度還是生物醫(yī)學應用的角度都很有意義。
　　本博士研究課題就是旨在開發(fā)原位蛋白質質譜。這是一個全新的概念，核心目標是揭示細胞內真實的蛋白質結構和蛋白質相互作用。技術上，核心是利用毫秒級微電泳去除復雜體系中的干擾基質，還包括使用非變性質譜和離子遷移質譜

3、等研究蛋白質相互作用研究的常用手段。應用上，本研究課題可以為蛋白質科學提供可靠的基礎研究手段，同時在細胞水平上進行抗癌靶向藥物的開發(fā)等方面也具有一定的工業(yè)應用價值。主要分成如下三個部分開展相關的研究:
　　1)集成連續(xù)超快電泳技術，開發(fā)原位蛋白質質譜平臺。
　　第一部分介紹如何擬集成連續(xù)超快電泳技術，開發(fā)原位蛋白質質譜平臺。搭建超快電泳平臺，實現(xiàn)毫秒量級微電泳分離行為:
　　a）搭建直流單脈沖高壓電源，實現(xiàn)1赫茲左右的

4、微電泳分離，
　　b）搭建可控連續(xù)脈沖電源，實現(xiàn)幾赫茲至幾千赫茲連續(xù)可調的微電泳行為。通過快速電泳，可在毫秒量級內實現(xiàn)復雜基質中的干擾物與目標化合物的初步分離，從而為后續(xù)電噴霧降低基質效應。利用高濃度生理鹽水等體系來模擬復雜基質，通過對模擬復雜基質中目標化合物的檢測效果，來評價其分離能力并研究快速電泳的分離機理。因此，我們設計了毛細管電泳-電噴霧質譜接口、常規(guī)尺寸下電噴霧中的離子抑制的緩解以及納升電噴霧中的離子抑制緩解等幾個方面的

5、實驗。
　　2)原位蛋白質質譜用于蛋白質分析。
　　本部分主要介紹如何用我們開發(fā)的原位蛋白質質譜技術對蛋白質進行結構表征和功能研究。分成如下兩部分內容:純溶液中的蛋白質鑒定分析和復雜體系中的蛋白質鑒定分析。純溶液中，我們進行了一系列的蛋白質結構相關的研究，包括用原位蛋白質質譜對雙硫鍵蛋白質的一級結構進行測序，以及開發(fā)單域蛋白質的折疊結構的可調、梯度地打開新方法，以探究蛋白質的構象變化。復雜體系中的蛋白質鑒定分析，則分別展示了

6、如何用原位蛋白質質譜技術在高鹽條件下、胎牛血清中、細胞裂解液以及完整活細胞內進行蛋白質的定性、定量分析。
　　3)原位蛋白質質譜用于蛋白質相互作用分析。
　　這部分我們將介紹原位蛋白質質譜技術在蛋白質相互作用中的應用。主要包含蛋白質-金屬離子相互作用和蛋白質-蛋白質相互作用等幾個方面。我們的主要蛋白質模型包括鋅指蛋白（NCp7，Sp1等）、鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)和血紅蛋白等。實驗場合從純溶液到細胞內的原位分