尼羅羅非魚cyp19a1a多克隆抗體制備及高溫誘導對其表達的影響.pdf

1、芳香化酶參與哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌,影響性行為和繁殖功能;并且可以調(diào)控非哺乳動物性腺分化,影響多種魚類的性別分化和性別決定。芳香化酶由芳香化酶基因cyp19a1編碼,在尼羅羅非魚中,存在兩種芳香化酶基因,分別為性腺型芳香化酶基因(cyp19a1a)和腦型芳香化酶基因(cyp19a1b),他們分別編碼性腺型芳香化酶(P450aromA)和腦型芳香化酶(P450aromB)。其中性腺型芳香化酶主要在性腺中,在其它組織中很

2、少表達甚至不表達。為了了解高溫對尼羅羅非魚性別分化相關(guān)基因表達的分子調(diào)控機制,本文通過RT-PCR技術(shù)獲得尼羅羅非魚cyp19a1a ORF區(qū),并進行了原核表達,純化了重組蛋白,免疫小鼠制備了多克隆抗體。對尼羅羅非魚進行36℃高溫處理,分析高溫誘導前后尼羅羅非魚性腺中cyp19a1a蛋白表達的變化情況。同時體外培養(yǎng)尼羅羅非魚卵巢細胞,并對卵巢細胞進行高溫處理,qRT-PCR分析離體情況下cyp19a1a以及hsp70的變化情況。

3、　　1、從尼羅羅非魚卵巢提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板后,利用設計的引物PCR擴增cyp19a1a ORF區(qū)1200bp片段,將擴增得到目的片段進行雙酶切并連接到pET-28a(+)表達載體上,經(jīng)酶切驗證和DNA測序鑒定后證明成功構(gòu)建了pET-28a-cyp19a1a原核表達載體。將表達載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中,優(yōu)化IPTG誘導濃度和誘導時間,結(jié)果顯示在0.5mM/L IPTG誘導8h后cyp19a1a重組蛋白大量表達,并以包

4、涵體形式存在。通過Ni2+-NTA層析柱和切膠純化后獲得與預期片段大小一致的表達蛋白,并用Western blotting驗證了純化的蛋白是目的蛋白。將純化的pET-28a-cyp19a1a重組蛋白注入昆明白小鼠內(nèi)并成功獲得多克隆抗體。用Western blotting驗證了多克隆抗體的有效性。用所得抗血清檢測高溫誘導前后尼羅羅非魚性腺中cyp19a1a的表達變化情況,發(fā)現(xiàn)高溫誘導后cyp19a1a的表達量顯著降低。
　　2、利用

5、組織塊貼壁法培養(yǎng)了尼羅羅非魚卵巢細胞,結(jié)果顯示尼羅羅非魚卵巢細胞能在含15％ FBS和5%魚血清的L-15培養(yǎng)液及29℃的培養(yǎng)條件下正常生長并具有連續(xù)傳代能力。同時,qRT-PCR分析37℃高溫誘導下尼羅羅非魚及體外培養(yǎng)卵巢細胞的hsp70和cyp19a1a基因的表達水平,結(jié)果顯示,高溫誘導能顯著上調(diào)羅非魚卵巢hsp70的表達量,而在體外培養(yǎng)的卵巢細胞中hsp70表達量也呈上升趨勢但不顯著,這說明體外尼羅羅非魚卵巢細胞對熱應激敏感;然而