小麥TaWRKY9基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、小麥?zhǔn)侨祟惐夭豢缮俚募Z食作物之一。干旱、低溫、高鹽等非生物脅迫和微生物致病體、昆蟲進(jìn)食等生物脅迫嚴(yán)重影響了小麥的生長發(fā)育和產(chǎn)量，因此，提高小麥對生物脅迫和非生物脅迫的抗性具有非常現(xiàn)實(shí)的意義。在惡劣的外界環(huán)境下，植物的生理生化過程會發(fā)生一些改變，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子起到了重要的調(diào)控作用。它不但參與植物生長發(fā)育和新陳代謝過程，而且還參與了植物應(yīng)對外界生物以及非生物的脅迫反應(yīng)。小麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控抗病相關(guān)基因、損傷誘導(dǎo)基因和衰老相關(guān)基因

2、的表達(dá)。因此，研究WRKY基因可為抗性小麥育種提供理論基礎(chǔ)。
　　在先前的研究中，已經(jīng)得到了在DNA水平和RNA水平上鑒定為陽性的TaWRKY9轉(zhuǎn)基因煙草植株，但還未在蛋白質(zhì)水平上得到鑒定。本課題首先培育中國春小麥（Triticum aestivum. L cv. Chinese Spring）幼苗，提取小麥RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后設(shè)計(jì)合適的引物、PCR反應(yīng)體系和程序克隆得到TaWRKY9基因，測序正確后將TaWRKY9基因與表

3、達(dá)載體pET32a相連，構(gòu)建原核表達(dá)載體，將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行原核表達(dá)，通過摸索OD600值、IPTG終濃度、溫度等幾個(gè)條件，成功誘導(dǎo)出分子量為67.93 kDa的目的蛋白，然后進(jìn)行可溶性檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白為包涵體蛋白，用含有尿素的變性A溶液將目的蛋白成功提取，最后通過膠回收將目的蛋白進(jìn)行純化后濃縮到一定濃度，即可作為抗原送到武漢病毒所免疫新西蘭兔得到多克隆抗體，最終用制備的抗體進(jìn)行Western-blot檢