擬蜘蛛牽絲蛋白基因的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、蜘蛛牽絲因其優(yōu)異的機(jī)械性能越來(lái)越多地作為材料應(yīng)用于醫(yī)療、建筑等領(lǐng)域。但天然蛛絲產(chǎn)量低，利用原核生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛛絲是目前人工獲得大量蛛絲的有效手段。本研究用擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)和二聚體(2S)分別構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX-S和pGEX-2S，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)其表達(dá)，用產(chǎn)量多的重組蛋白為抗原，免疫小白鼠以制備抗血清。通過(guò)此方法可以探索建立適宜的重組蛛絲原核表達(dá)體系，也為檢測(cè)其在真核表達(dá)提供材料。
　　本研究主要內(nèi)容包括

2、：⑴擬蜘蛛牽絲蛋白基因序列的合成:根據(jù)棒絡(luò)新婦蛛的cDNA片段人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)，并構(gòu)建了二聚體(2S)。⑵原核表達(dá)載體的構(gòu)建:基因單體（S)合成后與克隆載體pUC57相連，得到重組質(zhì)粒pUC57-S再通過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化等合成二聚體（2S）;分別將S和2S片段與表達(dá)載體pGEX-2T相連，獲得可用于原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pGEX-S和pGEX-2S。⑶重組蛋白的表達(dá)和純化:將重組質(zhì)粒pGEX-S和pGEX-2S轉(zhuǎn)化入表達(dá)

3、型感受態(tài)細(xì)胞BL21中，并對(duì)菌株的表達(dá)條件進(jìn)行了摸索，發(fā)現(xiàn)0.8mmol/l的IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)為最好。提取總蛋白進(jìn)行Western Blot，發(fā)現(xiàn)S-GST的表達(dá)量明顯高于2S-GST。利用親和層析法純化重組蛋白S-GST，用于多克隆抗體的制備。⑷擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體(S)多克隆抗體的制備:取適量純化后S-GST重組蛋白與佐劑混合乳化，利用皮下多點(diǎn)注射的方法免疫8只CDⅠ小白鼠，免疫結(jié)束后經(jīng)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的兩只小鼠的抗血清