超聲-微泡法介導(dǎo)外源性基因在細胞系和動物體內(nèi)定向性表達的研究.pdf

1、南京醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文超聲微泡法介導(dǎo)外源性基因在細胞系和動物體內(nèi)定向性表達的研究姓名：郭冬平申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：范樂明陳琪20060420南京醫(yī)科大學(xué)博士論文／微泡條件下，報告基因在人臍靜脈內(nèi)皮細胞系和小鼠心肌中的轉(zhuǎn)染和表達效率。激光共聚焦顯微鏡和流式細胞分析技術(shù)用于檢測細胞內(nèi)報告基因的表達效率。蟲熒光素酶活性的測定用來評價外源基因在小鼠心肌中的表達效率。同時通過對細胞活性的檢測以及小鼠血漿生化檢測對本基因轉(zhuǎn)移

2、系統(tǒng)的安全性進行評價。低密度脂蛋白受體基因在人肝癌細胞中的表達為了構(gòu)建質(zhì)粒表達載體LDLRpcDNAHis，人低密度脂蛋白受體基因的cDNA編碼序列被插入到質(zhì)粒表迭載體pcDNAmychis—A的多克隆位點。LDLRpcDNAHis和pLDLR—EGFPNl兩種質(zhì)粒表達載體分別制備純化，純化后的質(zhì)粒DNA與微泡進行混合。質(zhì)粒與微泡的混合液體加入到培養(yǎng)有人肝癌細胞(HepG2)的六孔板中，并對細胞進行超聲照射。轉(zhuǎn)染結(jié)束后流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染

3、效率。將DiI標(biāo)記的人低密度脂蛋白(LDL)加入到轉(zhuǎn)染外源性LDLR的培養(yǎng)板中，檢測細胞內(nèi)外源性人低密度脂蛋白受體是否具有正常的攝取配體的功能。最后westemblot檢測LDLRhis融合蛋白的表達情況。含有肝臟特異性啟動子的質(zhì)粒表迭載體在小鼠肝臟中的表達用含有六氟化硫氣體的微泡與超聲相結(jié)合，介導(dǎo)嵌合有肝臟特異性啟動子和增強子的質(zhì)粒表達載體在小鼠肝臟中表達。在不同超聲微泡條件下檢測報告基因蟲熒光素酶在小鼠不同臟器中的表達，特別是肝臟申