超聲介導(dǎo)微泡空化促基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制初探.pdf

1、心血管疾病的發(fā)病及死亡在全球高居首位，尤其是在發(fā)達(dá)國家，冠心病的實(shí)質(zhì)是因供應(yīng)不足導(dǎo)致的缺血和缺氧。近幾十年來，經(jīng)過人們的不斷努力取得了許多成就，循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo)下的新的更為合理的心血管藥物以及以冠狀動脈旁路搭橋術(shù)(CABG)和血管成形術(shù)(PTCA)為代表的血運(yùn)重建心肌再灌注療法，使冠心病尤其是急性心肌梗死的治療和預(yù)后取得了較大的進(jìn)步。然而，仍有諸多重要問題未予解決。例如，對于一些由于自身冠狀動脈病變復(fù)雜、嚴(yán)重、彌散、終末小分枝病變等，則不能

2、進(jìn)行PTCA和CABG冠脈重建；有些病人雖可進(jìn)行冠脈重建，但重建后血供仍不充分，缺血心肌瀕臨壞死、凋亡、纖維化；另外PTCA和CABG術(shù)后再狹窄問題，使心肌再灌注療法面臨挑戰(zhàn)。因此，尋求其它血運(yùn)重建策略迫在眉睫，人們寄厚望于稱為“分子搭橋”的治療性血管新生(Therapeuticangiogensis)以及心肌干細(xì)胞移植。 缺氧心肌微循環(huán)的代償包括微血管擴(kuò)張、儲備血管開通、微血管新生及動、靜脈側(cè)支形成，嚴(yán)重冠心病患者即使在合并使

3、用硝酸酯和鈣拮抗劑等藥物治療基礎(chǔ)上，內(nèi)源性的促血管生長調(diào)節(jié)下的微循環(huán)代償已達(dá)極限。因此，在藥物治療、血運(yùn)重建基礎(chǔ)上，通過輸入外源性的促血管生長因子，促進(jìn)心肌血管新生(TherapeuticAngiogenesis)、改善心肌缺血即心肌血管分子搭橋，是人們正在努力探索的研究熱點(diǎn)?；蛑委熞呀?jīng)成為治療遺傳性及獲得性疾病的一種重要手段?；騻鬏斢袃煞N載體：病毒與非病毒。盡管病毒載體有高效的傳輸效果，臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其副作用較大，非病毒載體傳輸越來

4、越受到人們的關(guān)注。分子生物學(xué)在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用及心肌分子搭橋基因治療的飛速發(fā)展，使分子搭橋已進(jìn)入臨床并進(jìn)行初步實(shí)踐；如開胸心肌注射VEGF121重組腺病毒、經(jīng)心內(nèi)膜和心包注射重組VEGF165和VEGF121真核表達(dá)質(zhì)粒、冠脈內(nèi)注射bFGF、VEGF165進(jìn)行血運(yùn)重建的臨床試驗(yàn)等。這些研究雖然取得了一些令人振奮的效果，但有創(chuàng)、高風(fēng)險的基因傳輸方式明顯限制了分子搭橋療法的深入開展。 超聲在基因和活性藥物靶向傳輸中的應(yīng)用是正在興起的

5、研究熱點(diǎn)，其核心是應(yīng)用超聲波及聲學(xué)造影劑微氣泡發(fā)展基因和藥物定向傳輸及釋放技術(shù)，即超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是將聲學(xué)造影劑微氣泡耦連或包載靶向藥物或基因，使載藥微泡在顯影心肌的同時，利用聲學(xué)造影劑微氣泡在超聲場內(nèi)發(fā)生的空化效應(yīng)，將基因和藥物運(yùn)載和釋放到特定的組織和器官，使局部組織達(dá)到有效的治療濃度。已有充分研究證實(shí)該系統(tǒng)的可行性和應(yīng)用前景，其全身給藥少、局部濃度高、無創(chuàng)、簡便、并可在床邊進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，給予當(dāng)前靶向性差、正處

6、于低迷狀態(tài)的基因療法以新的希望。 目的： 本研究擬在DNA轉(zhuǎn)染過程中，利用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、DNA免疫熒光標(biāo)記技術(shù)和聲學(xué)影像技術(shù)，觀察超聲波、微泡空化報告基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的增強(qiáng)作用；探討超聲波、微泡空化對內(nèi)皮細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞骨架生物作用，試圖初步闡明超聲介導(dǎo)微泡空化促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和分子機(jī)制，探索超聲介導(dǎo)微泡空化轉(zhuǎn)染基因的優(yōu)化條件，為超聲介導(dǎo)微泡空化靶向心肌傳輸治療基因的“分子搭橋”提供理論依據(jù)和實(shí)踐

7、指導(dǎo)。 材料與方法： 1、研究對象及分組 成功取材大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過程中6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染與白蛋白微泡孵育的報告基因eGFP質(zhì)粒，對不同組別的細(xì)胞發(fā)射超聲，并進(jìn)行定量分析報告基因的表達(dá)效率，探討靶向微泡的基因傳輸功能；不同條件下超聲照射大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，分別對細(xì)胞骨架微絲、微管行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及應(yīng)用軟件Simplepcr測量熒光強(qiáng)度并進(jìn)行分析；免疫

8、組化法NBD-C6-HPC探針行細(xì)胞膜染色，激光共聚焦顯微鏡觀察應(yīng)用FRAP技術(shù)間接測量不同條件下細(xì)胞膜流動性、熒光恢復(fù)率的變化，探討細(xì)胞膜流動性的改變與細(xì)胞轉(zhuǎn)染率之間的關(guān)系。 2、試驗(yàn)儀器及設(shè)備 全氟顯(南方醫(yī)科大學(xué)大學(xué)藥學(xué)部研制)；超聲影像系統(tǒng)Sequoia512(美國Acuson公司)；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司(德國)；DH5a工程菌(本校組織工程與構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室贈)；eGFP質(zhì)粒(美國Invitrogen公

9、司)；兔抗鼠微管蛋白一抗(美國LabVision公司)；羊抗兔二抗(美國KPL公司)；倒置熒光顯微鏡IX71(日本Olympus公司)，Simplepci熒光分析軟件(美國)；NBD-C6-HPC探針(美國MoleculeProbe公司)；牛血清白蛋白等。 3、試驗(yàn)方法 (1)超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸細(xì)胞模型的制備； 取全氟顯(全氟丙烷人血白蛋白微泡注射劑，南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)部)凍干制劑1支，用3mL生理鹽水溶解，

10、輕搖至混濁，4℃靜置2h。棄少許上層泡沫懸濁液，加入質(zhì)粒eGFP至終濃度為100mg/ml，置4℃冰箱2h。培養(yǎng)板中每孔換入含1％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基1.8ml，一組加入200μl微泡質(zhì)?；旌弦毫硪唤M加入200ml微泡。超聲照射24h后熒光顯微鏡下觀察。 (2)報告基因eGFP的大量制備； 復(fù)蘇大腸桿菌DH5a，常規(guī)搖菌擴(kuò)增，將報告質(zhì)粒eGFP-c2按氯化鈣法轉(zhuǎn)入細(xì)菌，藍(lán)、白菌落篩選法挑選陽性克隆菌落；大量擴(kuò)

11、增轉(zhuǎn)化細(xì)菌，按試劑盒況明書要求提取質(zhì)粒，Biophotometer生物分光光度計測質(zhì)粒濃度為300μg/mL，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1mg/mL。 (3)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的取材及培養(yǎng)； SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級)，質(zhì)量130～150g。無菌條件下取肺的邊緣，差速生長分離法去除平滑肌細(xì)胞，待內(nèi)皮細(xì)胞純度達(dá)95％以上用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞生長至第三代，傳代于6孔板中，處于對數(shù)生長期時用于實(shí)驗(yàn)。 (4)超聲介導(dǎo)

12、微泡空化對大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的影響； 超聲照射后，免疫組化染色微管、微絲蛋白，倒置熒光顯微鏡IX71(Olympus，日本)檢測并采集熒光圖像，Simplepcr(美國)計數(shù)細(xì)胞并進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。 (5)超聲介導(dǎo)微泡空化對細(xì)胞膜流動性的影響； 共聚焦專用培養(yǎng)皿中的細(xì)胞超聲照射后，不同條件超聲照射后探針NBD-C6-HPC標(biāo)記細(xì)胞膜，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡上的frap程序間接測定細(xì)胞膜流動性。 結(jié)

13、果： 1.順利完成大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的原代取材及純化；成功建立超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸細(xì)胞模型。 2.利用超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)在細(xì)胞水平傳輸報告基因，以全氟顯白蛋白微泡進(jìn)行傳輸時，與其他組相比，陽性對照組可見報告基因eGFP較強(qiáng)表達(dá)，報告基因轉(zhuǎn)染成功，超聲介導(dǎo)微泡空化有明顯促基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的作用。 3.不同MI與照射時間條件下實(shí)驗(yàn)組均能夠熒光細(xì)胞。MI為0.50～1.50范圍內(nèi)，基因轉(zhuǎn)染率與MI增加呈正相

14、關(guān)，MI為1.50～1.80范圍內(nèi)基因轉(zhuǎn)染率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲照射時間為60～90s細(xì)胞轉(zhuǎn)染率差別有統(tǒng)計學(xué)意義，但是延長照射時間，細(xì)胞轉(zhuǎn)染差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.利用超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸報告基因?qū)?xì)胞骨架無明顯損傷。MI為0.50～1.50范圍內(nèi)，微管蛋白熒光強(qiáng)度與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義，但是MI為1.50～1.80范圍內(nèi)微管熒光強(qiáng)度差別無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲照射時間為30～90s范圍內(nèi)微管蛋白強(qiáng)度改變與照射時間呈正相關(guān)

15、，繼續(xù)增加照射時間，微管熒光強(qiáng)度改變無統(tǒng)計學(xué)意義。 5.超聲介導(dǎo)微泡空化在一定聲學(xué)參數(shù)范圍內(nèi)使細(xì)胞膜流動性改變差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)超聲介導(dǎo)微泡空化能夠在細(xì)胞水平靶向傳輸報告基因，為超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸治療性藥物或者基因應(yīng)用于冠心病治療的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2.超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸基因在對細(xì)胞形態(tài)及骨架無明顯損傷作用，證實(shí)超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸?shù)陌踩浴?3.