超聲介導(dǎo)微泡空化促基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞機制初探.pdf

1、心血管疾病的發(fā)病及死亡在全球高居首位，尤其是在發(fā)達國家，冠心病的實質(zhì)是因供應(yīng)不足導(dǎo)致的缺血和缺氧。近幾十年來，經(jīng)過人們的不斷努力取得了許多成就，循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo)下的新的更為合理的心血管藥物以及以冠狀動脈旁路搭橋術(shù)(CABG)和血管成形術(shù)(PTCA)為代表的血運重建心肌再灌注療法，使冠心病尤其是急性心肌梗死的治療和預(yù)后取得了較大的進步。然而，仍有諸多重要問題未予解決。例如，對于一些由于自身冠狀動脈病變復(fù)雜、嚴重、彌散、終末小分枝病變等，則不能

2、進行PTCA和CABG冠脈重建；有些病人雖可進行冠脈重建，但重建后血供仍不充分，缺血心肌瀕臨壞死、凋亡、纖維化；另外PTCA和CABG術(shù)后再狹窄問題，使心肌再灌注療法面臨挑戰(zhàn)。因此，尋求其它血運重建策略迫在眉睫，人們寄厚望于稱為“分子搭橋”的治療性血管新生(Therapeuticangiogensis)以及心肌干細胞移植。 缺氧心肌微循環(huán)的代償包括微血管擴張、儲備血管開通、微血管新生及動、靜脈側(cè)支形成，嚴重冠心病患者即使在合并使

3、用硝酸酯和鈣拮抗劑等藥物治療基礎(chǔ)上，內(nèi)源性的促血管生長調(diào)節(jié)下的微循環(huán)代償已達極限。因此，在藥物治療、血運重建基礎(chǔ)上，通過輸入外源性的促血管生長因子，促進心肌血管新生(TherapeuticAngiogenesis)、改善心肌缺血即心肌血管分子搭橋，是人們正在努力探索的研究熱點?；蛑委熞呀?jīng)成為治療遺傳性及獲得性疾病的一種重要手段。基因傳輸有兩種載體：病毒與非病毒。盡管病毒載體有高效的傳輸效果，臨床試驗發(fā)現(xiàn)其副作用較大，非病毒載體傳輸越來

4、越受到人們的關(guān)注。分子生物學(xué)在心血管領(lǐng)域的應(yīng)用及心肌分子搭橋基因治療的飛速發(fā)展，使分子搭橋已進入臨床并進行初步實踐；如開胸心肌注射VEGF121重組腺病毒、經(jīng)心內(nèi)膜和心包注射重組VEGF165和VEGF121真核表達質(zhì)粒、冠脈內(nèi)注射bFGF、VEGF165進行血運重建的臨床試驗等。這些研究雖然取得了一些令人振奮的效果，但有創(chuàng)、高風(fēng)險的基因傳輸方式明顯限制了分子搭橋療法的深入開展。 超聲在基因和活性藥物靶向傳輸中的應(yīng)用是正在興起的

5、研究熱點，其核心是應(yīng)用超聲波及聲學(xué)造影劑微氣泡發(fā)展基因和藥物定向傳輸及釋放技術(shù)，即超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)。該系統(tǒng)的原理是將聲學(xué)造影劑微氣泡耦連或包載靶向藥物或基因，使載藥微泡在顯影心肌的同時，利用聲學(xué)造影劑微氣泡在超聲場內(nèi)發(fā)生的空化效應(yīng)，將基因和藥物運載和釋放到特定的組織和器官，使局部組織達到有效的治療濃度。已有充分研究證實該系統(tǒng)的可行性和應(yīng)用前景，其全身給藥少、局部濃度高、無創(chuàng)、簡便、并可在床邊進行等優(yōu)點，給予當前靶向性差、正處

6、于低迷狀態(tài)的基因療法以新的希望。 目的： 本研究擬在DNA轉(zhuǎn)染過程中，利用分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、DNA免疫熒光標記技術(shù)和聲學(xué)影像技術(shù)，觀察超聲波、微泡空化報告基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞的增強作用；探討超聲波、微泡空化對內(nèi)皮細胞膜的流動性、細胞骨架生物作用，試圖初步闡明超聲介導(dǎo)微泡空化促進內(nèi)皮細胞基因轉(zhuǎn)染的細胞和分子機制，探索超聲介導(dǎo)微泡空化轉(zhuǎn)染基因的優(yōu)化條件，為超聲介導(dǎo)微泡空化靶向心肌傳輸治療基因的“分子搭橋”提供理論依據(jù)和實踐

7、指導(dǎo)。 材料與方法： 1、研究對象及分組 成功取材大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞，實驗過程中6孔板培養(yǎng)細胞，待細胞處于對數(shù)生長期分別轉(zhuǎn)染與白蛋白微泡孵育的報告基因eGFP質(zhì)粒，對不同組別的細胞發(fā)射超聲，并進行定量分析報告基因的表達效率，探討靶向微泡的基因傳輸功能；不同條件下超聲照射大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞后，分別對細胞骨架微絲、微管行免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及應(yīng)用軟件Simplepcr測量熒光強度并進行分析；免疫

8、組化法NBD-C6-HPC探針行細胞膜染色，激光共聚焦顯微鏡觀察應(yīng)用FRAP技術(shù)間接測量不同條件下細胞膜流動性、熒光恢復(fù)率的變化，探討細胞膜流動性的改變與細胞轉(zhuǎn)染率之間的關(guān)系。 2、試驗儀器及設(shè)備 全氟顯(南方醫(yī)科大學(xué)大學(xué)藥學(xué)部研制)；超聲影像系統(tǒng)Sequoia512(美國Acuson公司)；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司(德國)；DH5a工程菌(本校組織工程與構(gòu)建實驗室贈)；eGFP質(zhì)粒(美國Invitrogen公

9、司)；兔抗鼠微管蛋白一抗(美國LabVision公司)；羊抗兔二抗(美國KPL公司)；倒置熒光顯微鏡IX71(日本Olympus公司)，Simplepci熒光分析軟件(美國)；NBD-C6-HPC探針(美國MoleculeProbe公司)；牛血清白蛋白等。 3、試驗方法 (1)超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸細胞模型的制備； 取全氟顯(全氟丙烷人血白蛋白微泡注射劑，南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)部)凍干制劑1支，用3mL生理鹽水溶解，

10、輕搖至混濁，4℃靜置2h。棄少許上層泡沫懸濁液，加入質(zhì)粒eGFP至終濃度為100mg/ml，置4℃冰箱2h。培養(yǎng)板中每孔換入含1％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基1.8ml，一組加入200μl微泡質(zhì)粒混合液另一組加入200ml微泡。超聲照射24h后熒光顯微鏡下觀察。 (2)報告基因eGFP的大量制備； 復(fù)蘇大腸桿菌DH5a，常規(guī)搖菌擴增，將報告質(zhì)粒eGFP-c2按氯化鈣法轉(zhuǎn)入細菌，藍、白菌落篩選法挑選陽性克隆菌落；大量擴

11、增轉(zhuǎn)化細菌，按試劑盒況明書要求提取質(zhì)粒，Biophotometer生物分光光度計測質(zhì)粒濃度為300μg/mL，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1mg/mL。 (3)大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的取材及培養(yǎng)； SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，SPF級)，質(zhì)量130～150g。無菌條件下取肺的邊緣，差速生長分離法去除平滑肌細胞，待內(nèi)皮細胞純度達95％以上用于實驗。細胞生長至第三代，傳代于6孔板中，處于對數(shù)生長期時用于實驗。 (4)超聲介導(dǎo)

12、微泡空化對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞細胞骨架的影響； 超聲照射后，免疫組化染色微管、微絲蛋白，倒置熒光顯微鏡IX71(Olympus，日本)檢測并采集熒光圖像，Simplepcr(美國)計數(shù)細胞并進行熒光強度分析。 (5)超聲介導(dǎo)微泡空化對細胞膜流動性的影響； 共聚焦專用培養(yǎng)皿中的細胞超聲照射后，不同條件超聲照射后探針NBD-C6-HPC標記細胞膜，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡上的frap程序間接測定細胞膜流動性。 結(jié)

13、果： 1.順利完成大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞的原代取材及純化；成功建立超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸細胞模型。 2.利用超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸系統(tǒng)在細胞水平傳輸報告基因，以全氟顯白蛋白微泡進行傳輸時，與其他組相比，陽性對照組可見報告基因eGFP較強表達，報告基因轉(zhuǎn)染成功，超聲介導(dǎo)微泡空化有明顯促基因轉(zhuǎn)染細胞的作用。 3.不同MI與照射時間條件下實驗組均能夠熒光細胞。MI為0.50～1.50范圍內(nèi)，基因轉(zhuǎn)染率與MI增加呈正相

14、關(guān)，MI為1.50～1.80范圍內(nèi)基因轉(zhuǎn)染率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲照射時間為60～90s細胞轉(zhuǎn)染率差別有統(tǒng)計學(xué)意義，但是延長照射時間，細胞轉(zhuǎn)染差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 4.利用超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸報告基因?qū)毎羌軣o明顯損傷。MI為0.50～1.50范圍內(nèi)，微管蛋白熒光強度與對照組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義，但是MI為1.50～1.80范圍內(nèi)微管熒光強度差別無統(tǒng)計學(xué)意義。超聲照射時間為30～90s范圍內(nèi)微管蛋白強度改變與照射時間呈正相關(guān)

15、，繼續(xù)增加照射時間，微管熒光強度改變無統(tǒng)計學(xué)意義。 5.超聲介導(dǎo)微泡空化在一定聲學(xué)參數(shù)范圍內(nèi)使細胞膜流動性改變差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.本實驗研究證實超聲介導(dǎo)微泡空化能夠在細胞水平靶向傳輸報告基因，為超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸治療性藥物或者基因應(yīng)用于冠心病治療的可行性提供實驗依據(jù)。 2.超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸基因在對細胞形態(tài)及骨架無明顯損傷作用，證實超聲介導(dǎo)微泡空化靶向傳輸?shù)陌踩浴?3.