一種煙草普通花葉病毒拮抗細菌活性物質(zhì)的分離純化及其作用機制研究.pdf

1、植物病毒病是農(nóng)作物的重要病害之一。目前，抗植物病毒劑的防治效果或安全性還不理想，遠遠不能滿足農(nóng)業(yè)的需求，急需開發(fā)新型抗病毒制劑。盡管化學(xué)農(nóng)藥現(xiàn)在仍占主體，但從可持續(xù)發(fā)展的角度考慮，發(fā)展能產(chǎn)生高效、高活性的生物源抗病毒劑是實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生物防治中的關(guān)鍵任務(wù)。對我國來說，微生物來源的生物化學(xué)農(nóng)藥是生物農(nóng)藥發(fā)展的主體。 1.從春季及夏季煙草的病、健葉、種子及土壤中共分離劍127個菌株，搖瓶發(fā)酵后，分別取發(fā)酵液，室內(nèi)經(jīng)半葉法測定其對煙草普通

2、花葉病毒(TobaccoMosaicVirus，TMV)的拮抗作用，得到一個對TMV有很強拮抗活性的細菌菌株，根據(jù)生理生化特性和16SrDNA序列鑒定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，命名為CZ，其抑病毒率可達96.73％。初步確定該菌株發(fā)酵液中的抗病毒活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)，命名為CZp。并對拮抗細菌CZ產(chǎn)生活性物質(zhì)的搖瓶發(fā)酵條件進行了初步研究。研究表明，CZ菌株適宜的搖瓶發(fā)酵條件是：NB培養(yǎng)基、初始pH8.0

3、、通氣量30ml/100ml、發(fā)酵溫度25℃、發(fā)酵時間60h。 2.對活性蛋白CZp進行了分離純化。利用硫酸銨分級沉淀獲得粗提蛋白，并通過紫外(波長220～340nm)掃描，該物質(zhì)在280nm處有紫外吸收峰，進一步確定其為蛋白類物質(zhì)。發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨粗沉淀及預(yù)處理后，采用離子交換層析和分子篩層析等方法對活性物質(zhì)進行了純化，經(jīng)SDS-PAGE測定其亞基的相對分子質(zhì)量為13.5kD，并對其部分理化特性進行初步分析。結(jié)果表明：拮抗活性蛋

4、白CZp穩(wěn)定性較好，對酸、堿較敏感，不能忍受強酸強堿的環(huán)境條件；對溫度不十分敏感，但是不能忍受長時間的持續(xù)高溫；對光照不敏感，但隨著光照時間的增長，活性略有下降；對蛋白酶K和胰蛋白酶均不敏感，用兩種酶處理后，仍能保持原有的活性。 3.以枯斑三生煙(Nicotianatabacumvar.samsunNN)和普通煙(Nicotianatabacumvar.NC89)為寄主材料，以TMV為供試毒源，從生理生化的角度初步探索了活性蛋白

5、CZp對TMV的作用機理，主要得到以下結(jié)果：(1)CZp具有抑制TMV在煙草體內(nèi)復(fù)制增殖的能力。葉圓片法試驗結(jié)果表明，研磨接種后，在CZp粗提液中懸浮的圓片比在蒸餾水中懸浮的枯斑數(shù)降低89.19％，說明CZp對病毒在煙草體內(nèi)的復(fù)制增殖有一定的抑制作用。(2)CZp具有誘導(dǎo)寄主對TMV產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的能力。用CZp對枯斑三生煙下部葉片進行誘導(dǎo)處理(清水處理作對照)，然后在其上部葉片接種TMV。結(jié)果表明，CZp可以誘導(dǎo)枯斑三生煙對TMV產(chǎn)生系

6、統(tǒng)抗性，其中以誘導(dǎo)處理第4天的枯斑抑制率為最高，可達81.76％，枯斑出現(xiàn)時間推遲10h以上。(3)以CZp處理NC89煙12h后，摩擦接種TMV。第1天、5天、8天、12天、16天分別取各處理葉片測過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CZp能夠誘導(dǎo)普通煙葉片中的POD及PAL等細胞防御酶活性增強。(4)第1天、5天、8天、12天、16天分別取各處理葉片測定NC89葉片中丙二醛(MDA)和葉綠素的含量。結(jié)果表明