煙草花葉病毒的人工功能化研究.pdf

1、煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）為Tobamovirus屬，病毒顆粒含有一條6395 nt單股RNA正義鏈（+ssRNA），其RNA被2130個(gè)相同的殼蛋白亞基所包裹，形成長度300nm和直徑18nm的螺旋桿狀結(jié)構(gòu)體。TMV殼蛋白具有極其有序的螺旋堆積方式和簡單快速的組裝特性，其組裝依賴于RNA起始組裝位點(diǎn)和20S Disk殼蛋白的相互識別與結(jié)合作用，病毒顆粒延伸不具RNA序列組成和長度依賴性，只要包含起

2、始組裝位點(diǎn)的RNA都能與病毒殼蛋白復(fù)合物的進(jìn)行有序組裝，這是TMV尺度可控組裝的理論基礎(chǔ)。
　　病毒組裝體表面具有活性化學(xué)基團(tuán)，利用新型高效的蛋白標(biāo)記方法對殼蛋白實(shí)現(xiàn)溫和化學(xué)修飾，可以延展病毒組裝體表面物理化學(xué)性質(zhì)。因組裝顆粒具有較高的穩(wěn)定性，并保持著較高的宿主侵染活性，能有效地將病毒核酸重組體遞送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)?；赗NA干擾在植物系統(tǒng)中基因調(diào)控作用的重要性，能通過病毒組裝體在植物內(nèi)實(shí)現(xiàn)外源基因或內(nèi)含子shRNA表達(dá)，從而拓寬病毒組裝

3、體的新生物學(xué)性質(zhì)。
　　如何利用病毒組裝機(jī)制，突破天然病毒納米顆粒的尺度單一性，如何高效實(shí)現(xiàn)病毒顆粒表面可控修飾及如何將TMV以一種全新的基因組編輯策略發(fā)展為RNA干擾載體，這些問題的解決有助于發(fā)展一類多層次調(diào)控的復(fù)合病毒組裝體，挖掘其在病毒材料應(yīng)用、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)中的潛在價(jià)值。
　　本論文從如下四個(gè)方面著手展開，主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1） TMV組裝體制備與尺度調(diào)控
　　病毒尺度依賴于病毒基因組長度大小

4、，要得到不同長度的病毒顆粒，首先需要不同長度的TMV DNA，通過轉(zhuǎn)錄得到不同長度的RNA，進(jìn)一步通過病毒組裝來實(shí)現(xiàn)長度可控病毒顆粒的制備。對于尺度小于300nm的組裝體，可以直接通過設(shè)計(jì)特異性引物，通過 PCR擴(kuò)增不同長度的含有起始組裝位點(diǎn)的DNA模板（100nm,200nm,300nm），而對于400nm組裝體，通過在TMV基因組中5709-5712nt插入一段2001bp的GUS-INT基因（β-葡萄糖苷酸酶），增加病毒基因組長度

5、。這些不同尺度的病毒組裝體通過微球菌核酸酶抗性試驗(yàn)、透射電鏡和原子力顯微鏡表征，結(jié)果表明RNA能為殼蛋白聚集體有效包裹，組裝率接近50-80％，并能夠組裝成預(yù)期的長度，通過這種基于PCR擴(kuò)增和體外轉(zhuǎn)錄的聯(lián)用方法可以有效實(shí)現(xiàn)TMV顆粒的不同尺度調(diào)控，并能保證組裝體的相對均一性與穩(wěn)定性。
　　2）TMV組裝體的表面化學(xué)修飾與功能化
　　基于TMV病毒組裝體制備與尺度調(diào)控，將包含不同功能基團(tuán)的重氮鹽直接與病毒表面Tyr殘基上的酚羥

6、基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，在病毒模板表面成功引入多種功能基團(tuán)，如炔基、酮基、巰基、多羥基、氨基和重氮對稱體。結(jié)果表明，炔基的引入提高基于Click反應(yīng)的FITC和PEG的特異性連接效率，而酮基的引入增加了病毒表面對氨基官能團(tuán)的特異性反應(yīng)敏感性，進(jìn)而又能在氨基的基礎(chǔ)上引入巰基，實(shí)現(xiàn)多層次的病毒表面化學(xué)修飾。
　　氨基、巰基和羥基的引入不僅增加了病毒表面熒光修飾的方法多樣性，而且也相應(yīng)提高了對無機(jī)重金屬鹽的附著力。不同尺度的病毒組裝體經(jīng)過硫化鎘

7、礦物化后，通過透射電鏡、能譜、紫外可見光譜表征確定，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和均一性，并呈現(xiàn)新的紫外可見光譜和熒光發(fā)射光譜性質(zhì)。另外，通過引入多巴胺和硝基重氮鹽分別實(shí)現(xiàn)表面多羥基化和氨基羥基化的策略不能有效實(shí)現(xiàn)病毒表面硫化鎘礦物化。除了實(shí)現(xiàn)病毒表面功能化外，通過改造的重氮鹽對稱體可實(shí)現(xiàn)病毒表面之間相互交聯(lián)，該交聯(lián)分子體現(xiàn)出較高的Tyr特異性和高效性，交聯(lián)速度快，具有廣泛生物應(yīng)用前景。
　　3）內(nèi)含子介導(dǎo)的TMV RNA干擾載體構(gòu)建與功能

8、研究
　　基于TMV的生物學(xué)特點(diǎn)和基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律，對病毒RNA進(jìn)行基因組重編輯，賦予病毒組裝體新的生物學(xué)特性。通過外源GFP基因整合于T7-TMV-CP-MCS6（殼蛋白保留型）和T7-TMV-AGA-△CP-MCS4（殼蛋白缺失型）載體中，比較兩類載體在GFP表達(dá)量和病毒系統(tǒng)性遷移方面的差異，結(jié)果表明外源基因的插入不會破壞兩類載體上原有亞啟動(dòng)子的二級結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄活性，但殼蛋白的保留與否直接影響到病毒的系統(tǒng)性侵染力。
　　從

9、基因表達(dá)水平上看，含有內(nèi)含子序列的一段外源基因能正常表達(dá)活性蛋白。在原有的外源片段插入位點(diǎn)，分別替換為無內(nèi)含子序列、含內(nèi)含子序列和內(nèi)含子shRNA的GUS基因片段（GUS-△INT、GUS-INT和GUSi），在感染煙草葉片組織中比較GUS基因表達(dá)豐度與序列長度變化，驗(yàn)證TMV RNA是否能參與內(nèi)含子剪接過程和內(nèi)含子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因后沉默機(jī)制是否也存在植物系統(tǒng)中。GUS酶活性定性定量檢測和反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果表明，在感染含有內(nèi)含子序列（267

10、bp）與內(nèi)含子shRNA（328bp）的TMV顆粒的煙草葉片中，不僅能檢測到較高的GUS酶活性，而且還能檢測到內(nèi)含子剪接后的基因片段（78bp），而對應(yīng)突變體感染的煙草中沒有檢測到GUS酶活性和相應(yīng)78bp特征條帶，這揭示出含內(nèi)含子序列的TMV RNA可能會進(jìn)行類似內(nèi)含子選擇性剪接的過程，從而能夠翻譯出正常活性的酶蛋白或產(chǎn)生shRNA沉默靶標(biāo)基因。
　　從基因沉默水平上看，含有GUS shRNA的殼蛋白缺失型載體能達(dá)到68.4%基

11、因沉默效率，而含有GUS shRNA的殼蛋白保留型載體能達(dá)到59.1%基因沉默效率，病毒總RNA含量和殼蛋白轉(zhuǎn)錄水平也隨之下調(diào)。另外，殼蛋白保留型載體相比殼蛋白缺失型載體表現(xiàn)出較強(qiáng)的病毒系統(tǒng)性遷移能力，在煙草體內(nèi)能正常構(gòu)建成預(yù)期400nm的組裝體，體現(xiàn)較好的均一性與穩(wěn)定性?；谳^好的基因沉默效率和病毒顆粒組裝體在植株內(nèi)的穩(wěn)定性，將病毒組裝體發(fā)展為新型TMV RNA干擾載體成為可能。
　　4）煙草花葉病毒組裝體對植物內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄后

12、沉默調(diào)控
　　通過替換原有基礎(chǔ)上的GUS shRNA靶點(diǎn)序列，探討這種替換是否仍然保留植物內(nèi)源性基因沉默的作用，以此發(fā)展一類具有生物普適性的新型人工化的煙草花葉病毒組裝體。靶標(biāo)基因選取了半胱氨酸合成酶（CS）、乙酰羥基酸合成酶（AHAS）和原卟啉原氧化酶（PPO）三類基因。替換為CS、AHAS和PPO的重組病毒在煙草內(nèi)能正常表達(dá)具有活性的GUS酶，揭示出病毒重組體在煙草內(nèi)發(fā)生了選擇性剪接過程，能正常產(chǎn)生內(nèi)含子shRNA，表達(dá)的GU

13、S酶活性較高。
　　從內(nèi)源性基因沉默水平上看，新型病毒重組載體對植物內(nèi)源性基因起到了一定程度的沉默下調(diào)作用，但對于不同基因表現(xiàn)的沉默效率具有差異性。對CS基因而言，殼蛋白缺失型和殼蛋白保留型載體對CS基因有15.7%和20.7%基因沉默效率，而對PPO基因而言，兩類載體都沒有表現(xiàn)出可檢測到的基因沉默活性。但對AHAS基因而言，蛋白缺失型和殼蛋白保留型載體對AHAS-A基因分別有48.9%和29%基因沉默效率，而殼蛋白缺失型和殼蛋白

14、保留型載體對AHAS-B基因分別有36.6%和51.8%基因沉默效率。這些結(jié)果表明，構(gòu)建這樣一類新型病毒重組體的策略能夠?qū)崿F(xiàn)植物內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄后沉默下調(diào)作用，驗(yàn)證了將這種新型人工功能化的煙草花葉病毒適用于植物RNA干擾載體發(fā)展中的可行性，但植物內(nèi)源性基因沉默效率可能與shRNA序列、基因靶標(biāo)種類和病毒侵染時(shí)間等相關(guān)，需要后期的優(yōu)化以提高病毒組裝體的沉默活性高效性與生物適用性。
　　綜合上述，本研究從RNA依賴性的病毒殼蛋白自組裝