辣椒煙草花葉病毒的分子鑒定及檢測技術(shù)研究.pdf

1、辣椒系茄科辣椒屬一年或有限多年生草本植物，其營養(yǎng)價值極高，堪稱―蔬菜之冠。作為辣椒產(chǎn)銷大省，貴州辣椒常年栽培面積500萬畝左右，約占中國的20％，產(chǎn)值150億左右，其經(jīng)濟對辣椒產(chǎn)業(yè)的依賴程度有上升之勢。然而，近年來隨著辣椒種質(zhì)的交流，病毒隨之?dāng)U散，并產(chǎn)生越來越嚴(yán)重的危害，造成極大的經(jīng)濟損失。因此，對辣椒病毒病的早期診斷并采取一定的防范措施對減少經(jīng)濟損失具有重要意義。煙草花葉病毒(Tobacco Mosaic Virus，TMV)隸屬于煙

2、草花葉屬（Tobamovirus），為(+)ssRNA病毒，主要通過汁液傳播，病健葉輕微摩擦造成微傷口，病毒即可侵入，對辣椒的危害日益擴大。對植物病毒分離物進行分子鑒定并研究開發(fā)出快速靈敏的檢測方法對病毒病的早期預(yù)防具有重要的理論及實踐意義。本研究對采自貴州的辣椒病樣進行了ELISA檢測，對TMV貴州辣椒分離物（TMV-GZ）進行了分子鑒定，建立了同步檢測TMV、PMMoV和CMV三種辣椒重要病毒的多重RT-PCR方法和檢測TMV的核酸

3、斑點雜交方法，同時，建立并優(yōu)化了TMV外殼蛋白（CP）基因的原核表達體系，以期為TMV抗血清的制備及免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。本研究獲得的主要結(jié)論如下：
　　1．成功克隆了TMV-GZ分離物全長CP基因序列，該基因長為480 bp，編碼18 kDa的CP蛋白。TMV-GZ分離物CP基因序列與同屬異種病毒的同源性僅為32%-65%，序列差異明顯；相反，它與11個TMV病毒分離物的同源性在98%-99%之間；TMV及其它病毒分離物

4、聚類形成3個明顯分支，TMV-GZ與其他11個TMV分離物親緣關(guān)系較近，而與同屬其他3種病毒之間的進化距離較遠，證實該分離物確為TMV。
　　2．根據(jù)煙草花葉病毒(TMV)、辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)和黃瓜花葉病毒(CMV)的外殼蛋白(CP)編碼序列設(shè)計了3對PCR檢測引物，通過條件優(yōu)化建立了同步檢測以上3種辣椒病毒的多重RT-PCR方法。該多重 RT-PCR體系不對ORSV、PVX和PVY等同屬或不同屬的其它病毒發(fā)生反應(yīng)，特異

5、性好；可檢測到104×稀釋的病毒cDNA模板，具有較高的靈敏度，可用于PMMoV、TMV和CMV3種辣椒病毒的同步檢測。
　　3.基于TMV的CP序列，采用隨機引物法制備了地高辛標(biāo)記的TMV雙鏈cDNA雜交探針（DIG-TMV CP），并初步建立了快速檢測TMV的核酸斑點雜交（NASH）方法，該法具有較好的特異性和靈敏度（可檢測到625×稀釋的病毒RNA）。
　　4.構(gòu)建了TMV CP基因的原核表達載體pET32a_TMV