肺癌患者胸腔積液中VEGF、VEGFmRNA及EndostatinmRNA的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、目的：
　　 肺癌是我國(guó)高發(fā)腫瘤，且絕大多數(shù)肺癌可引起惡性胸水，目前臨床上常用的胸腔積液查瘤細(xì)胞的方法敏感性甚低，文獻(xiàn)報(bào)道為58％，部分胸腔內(nèi)已有明顯腫瘤轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的患者，胸腔積液中細(xì)胞學(xué)檢查仍可為陰性。
　　 常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查主要是依靠癌細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行診斷。由于癌細(xì)胞在積液中無(wú)組織及器官構(gòu)架的束縛而自由漂浮和增生甚至經(jīng)幾代繁殖，失去了原來(lái)在組織中的形態(tài)特征，故單純依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行診斷敏感性較低，尤其是較早期異型性不太

2、明顯的癌細(xì)胞與反應(yīng)性間皮細(xì)胞幾乎無(wú)法區(qū)別，以至造成診斷結(jié)果中存在著相當(dāng)數(shù)量的假陰性。建立一組科學(xué)、有效的診斷方法是提高肺癌診斷陽(yáng)性率的有效途徑，也是提高肺癌患者生存率與治愈率的關(guān)鍵。
　　 本課題以目前國(guó)內(nèi)外死亡率較高的肺癌為主攻對(duì)象，以肺癌患者的胸水為檢測(cè)基礎(chǔ)，采用RT-PCR方法檢測(cè)癌細(xì)胞中VEGF和內(nèi)皮抑素的轉(zhuǎn)錄水平；采用免疫細(xì)胞化學(xué)[2]檢測(cè)VEGF在癌細(xì)胞中的定位表達(dá)。探討診斷肺癌性胸水的新途徑，評(píng)價(jià)這三種檢測(cè)指標(biāo)單-

3、和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺癌性胸水的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：
　　 收集中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2008年4月至2009年11月門診及住院患者128例，其中：原發(fā)性肺癌92例，肺良性疾病患者36例。
　　 1、免疫細(xì)胞化學(xué)染色
　　 (1)收集胸水中細(xì)胞沉渣制作石蠟包埋塊。
　　 (2)切片，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法（streptavidin-peroxidase，S-P）染色。檢測(cè)VEGF的表達(dá)情況。

4、>　　 2、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverese transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的分析
　　 (1)收集胸水中細(xì)胞沉渣提取總RNA。
　　 (2)總RNA的反轉(zhuǎn)錄及VEGF和endostatin基因片段的擴(kuò)增。
　　 (3)銀染色觀察并分析結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGF，RT-PCR檢測(cè)VE

5、GF-mRNA和endostatin-mRNA在肺癌患者胸水中的陽(yáng)性率均高于良性胸水中陽(yáng)性表達(dá)率，差異非常顯著(P＜0，05)。
　　 2、用RT-PCR的方法聯(lián)合檢測(cè)VEGF-mRNA和endostatin-mRNA其敏感性和準(zhǔn)確性分別是95.7％(88/92)，93.7％(120/128)，明顯高于單項(xiàng)檢測(cè)和常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查。
　　 3、檢測(cè)VEGF、VEGF-mRNA及endostatin-mRNA在肺腺癌性胸腔積液

6、與肺鱗癌性胸腔積液中比較，兩者差異不顯著(P＞0.05)。
　　 4、肺癌患者胸腔積液中VEGF-mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率(82.6％)高于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGF陽(yáng)性表達(dá)率(71.7％)(P＜0.05)，檢測(cè)VEGF-mRNA對(duì)肺癌胸膜微轉(zhuǎn)移具有臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 討論
　　 在胸腔積液產(chǎn)生的過(guò)程中，血管生成因子和抑制血管生成因子都起到重要的作用。VEGF和endostatin分別是目前研究發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)，特異性

7、最高的血管生成促進(jìn)因子和抑制因子。尤其是肺癌引起的胸腔積液中，VEGF被認(rèn)為是最重要的血管生成因子之一，對(duì)胸腔積液的產(chǎn)生起到了重要的作用。以前的研究表明，VEGF能促進(jìn)腫瘤血管生成，以提供腫瘤生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)條件，并進(jìn)一步為腫瘤的轉(zhuǎn)移打下基礎(chǔ)，同時(shí)可能通過(guò)多種途徑刺激產(chǎn)生大量的endostatin，抑制原發(fā)和繼發(fā)腫瘤血管的生成，與血管生成促進(jìn)因子的作用對(duì)抗，達(dá)到一種平衡。
　　 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)胸水內(nèi)的微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞，以達(dá)

8、到早期診斷目的。該方法具有較高的敏感性，可在106～107個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到1個(gè)目標(biāo)細(xì)胞。此外，RNA在細(xì)胞外環(huán)境中非常不穩(wěn)定，如在胸水內(nèi)檢測(cè)出VEGF-mRNA和endostatin-mRNA，則從理論上可以認(rèn)為胸水中有癌細(xì)胞的存在。以前的研究表明，endostatin的產(chǎn)生能抑制VEGFmRNA的合成，且早期肺癌患者胸腔積液中內(nèi)皮抑素的水平是增高的，本研究采用了endostatin-mRNA和VEGF-mRNA聯(lián)合診斷的方法，能進(jìn)一步提

9、高診斷的敏感度和準(zhǔn)確度。本課題中，有4位癌癥患者的標(biāo)本，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)是良性，但我們的結(jié)果顯示endostatin-mRNA和VEGF-mRNA都為陽(yáng)性，我們的實(shí)驗(yàn)比細(xì)胞學(xué)更早更準(zhǔn)確的判斷出了患者的病情。本研究結(jié)果提示在惡性胸腔積液的形成過(guò)程中內(nèi)皮抑素和VEGF扮演了重要的角色，這與以前研究的結(jié)果是一致的。
　　 本研究中，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VEGF，RT-PCR方法檢測(cè)VEGF-mRNA和endostatin-mRNA可有效的提

10、高肺癌胸水診斷的敏感度，單獨(dú)應(yīng)用敏感度最高的為VEGF-mRNA達(dá)82.6％，三種檢測(cè)指標(biāo)兩兩聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，兩種檢測(cè)方法單一及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肺癌性胸水診斷效能的比較，VEGF-mRNA和endostatin-mRNA聯(lián)合應(yīng)用有較高的敏感度和準(zhǔn)確度分別是95.7％(88/92)，93.7％(120/128)對(duì)診斷癌性胸水有重要的臨床價(jià)值，可作為研究早期癌細(xì)胞播散的一種重要方法，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用免