皂角苷佐劑對大菱鲆重要免疫基因的表達及非特異免疫的影響.pdf

1、細菌性疾病是威脅水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類健康的主要原因之一。長期以來,采用化學(xué)制劑和抗生素類藥物治療魚病,不僅病原菌耐藥性增強,還會使魚體藥物殘留而對人類造成間接地傷害。魚類疾病控制正在向用魚用疫苗放置方向發(fā)展。魚病的疫苗免疫防治技術(shù)是最佳的魚病防治策略,但魚類的特殊生活環(huán)境,注射和口服免疫接種的方式都不是最優(yōu)途徑,浸泡則成為魚用疫苗的首選。為了增強浸泡疫苗的免疫保護效果,本研究以前期篩選出的皂角苷為佐劑,以甲醛滅活鰻弧菌疫苗,以大菱鲆為實驗魚類,

2、從魚類非特異性免疫和特異性免疫兩個方面,對皂角苷的佐劑功能進行評價,以期從分子水平上闡明皂角苷佐劑的免疫機理。
　　第一部分,以不同濃度的皂角苷(15mg/L、35 mg/L)為佐劑,用滅活鰻弧菌為浸泡疫苗免疫大菱鲆,采用腹腔注射為陽性對照組,對免疫后不同時間段內(nèi)各主要免疫器官(皮膚、鰓、頭腎、脾臟和腸組織)中各主要免疫相關(guān)基因的表達量進行了定量分析。結(jié)果表明,在兩組皂角苷佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組的大菱鲆的鰓組織中,MHCⅡα基因在浸泡

3、的4~8 h內(nèi),即表現(xiàn)出顯著的表達,相對表達量分別為136.3和378.5,1d后表達量迅速降低。高濃度的皂角苷組及皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組在浸泡8 h時的大菱鲆皮膚中,MHCⅡα基因的相對表達量即可出現(xiàn)顯著提高,相對表達量47.1和41.9,3~15d內(nèi),皮膚中MHCⅡα基因的相對表達量最高的一組出現(xiàn)在低濃度皂角苷(15mg/L)聯(lián)合疫苗浸泡組,表達量為57.6。浸泡1 d后,脾臟中MHCⅡα基因相對表達最高的組出現(xiàn)在注射對照組中,且該基

4、因的高相對表達量在脾臟持續(xù)至15 d。在脾臟中,浸泡3 d~15 d內(nèi)低濃度皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組的MHCⅡα基因呈現(xiàn)次高相對表達量,僅次于注射組,顯著高于其他各組(P<0.05),在頭腎中,浸泡后的第3 d,兩組皂角苷聯(lián)合疫苗浸泡組的MHCⅡα基因呈現(xiàn)高相對表達量,兩組表達差異不顯著(P>0.05)。而在注射組中,頭腎的MHCⅡα基因表達從浸泡后的第3 d開始,到第15 d時呈現(xiàn)最高值,相對表達量分別到達6.37,顯著高于其他各組(P<

5、0.05)。對IL-1β基因在皮膚、鰓、頭腎、脾臟和腸中的表達分析結(jié)果顯示,皮膚中IL-1β表達的最高值,出現(xiàn)在佐劑聯(lián)合疫苗組,其中低濃度組(15mg/L)比高濃度組(35mg/L)的表達高,二者顯著高于其他組(P<0.05),相對表達量分別為14.01和11.02。IL-1β與MHCⅡα在皮膚中的表達趨勢相同,鰓中IL-1β表達的最高值,同樣出現(xiàn)在佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組,分別達到21.58和32.58,且顯著高于其他各組(P<0.05)。

6、頭腎和脾臟組IL-1β表達的最高值都出現(xiàn)在4 h的注射組,表達量分別是169.53和222.1,顯著高于其他各組(P<0.05)。頭腎和脾臟兩個組織中,佐劑聯(lián)合疫苗組表達優(yōu)于其他各組,但差異不顯著(P>0.05)。腸中IL-1β的的表達的最高值仍然出現(xiàn)在注射組,表達量為24.51,次高組為高濃度佐劑聯(lián)合浸泡疫苗組,表達量達到20.02。TNF-α在皮膚中的表達高峰出現(xiàn)在7d的低濃度佐劑加疫苗組,其他各組差異不顯著。鰓中的表達量最高出現(xiàn)在

7、7d注射組,同時間佐劑加疫苗組的表達是次高值。佐劑加疫苗組的腸中TNF-α的表達在8 h時出現(xiàn)明顯上調(diào),顯著高于其他各組,而15 d的注射組才開始上調(diào)。脾臟中TNF-α表達只有注射組在7 d時顯著升高是其他各組的近百倍。頭腎中的最高值出現(xiàn)在單佐劑組,而注射組在整個事件段都顯示出明顯優(yōu)勢。
　　對大菱鲆背腹面不同分區(qū)的皮膚進行三種基因表達分析表明,MHCⅡα基因表達量最高的出現(xiàn)在鰓蓋下方皮膚,達到6.56。其次是尾部側(cè)線達到6.31

8、,腹面抗原呈遞效果不明顯。IL-1β和TNF-α基因的表達趨勢與MHCⅡα的相同。
　　結(jié)果表明,皂角苷聯(lián)合鰻弧菌疫苗浸泡免疫大菱鲆后,可以顯著提高疫苗抗原在皮膚等組織中呈遞,同時引發(fā)相應(yīng)組織的炎癥反應(yīng)。
　　本文第二部分評價了皂角苷增強魚類非特異免疫效果,分別用濃度為0、15和35 mg/L的皂角苷浸泡大菱鲆,分析了浸泡后6、12、24、48和72 h時大菱鲆白細胞的吞噬活力、血清補體旁路途徑溶血活性、血清與黏液中溶菌酶活

9、性、抑菌活性與堿性磷酸酶活性及血清總蛋白濃度。結(jié)果顯示,皂角苷低濃度組(15 mg/L)與高濃度組(35 mg/L)大菱鲆白細胞吞噬活力分別在浸泡后12 h與24 h出現(xiàn)顯著的增高(P<0.05)。實驗組大菱鲆血清中補體旁路途徑溶血活性除低濃度組在12 h與24 h較對照組低外,其他檢測時段均高于對照組(P<0.05)。血清溶菌酶活性最高值出現(xiàn)在低濃度組浸泡后6h時,黏液中未能檢測出。不同時間點各組大菱鲆黏液抑菌活力變化幅度較大,兩實驗

10、組黏液抑菌活力在浸泡后6h與12h時較對照組提高,兩個實驗組間無差異(P>0.05)。血清中AKP活力高峰值出現(xiàn)在浸泡后6 h與12 h,該時段AKP的活力顯著高于對照組,且實驗組間存在差異(P<0.05),而黏液中AKP高峰值出現(xiàn)在12 h,該時段AKP的活力顯著高于對照組(P<0.05),實驗組間無差異。浸泡皂角苷后6 h高濃度組血清中蛋白濃度達到最高值,除12 h時各組差異不顯著外(P>0.05),24 h~72 h高濃度組中血清