鰻弧菌感染對(duì)兩種蝦Imd免疫通路相關(guān)基因表達(dá)及非特異性免疫因子的影響.pdf

1、中國(guó)明對(duì)蝦和脊尾白蝦作為重要的養(yǎng)殖蝦類(lèi)，在我國(guó)沿海均有廣泛分布。隨著市場(chǎng)需求的加大，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷增加，養(yǎng)殖過(guò)程中環(huán)境的惡化使得養(yǎng)殖蝦類(lèi)的抗病力下降，伴隨病害的發(fā)生，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，通過(guò)對(duì)比不同種蝦類(lèi)的抗病能力，發(fā)掘和分析免疫相關(guān)基因及非特異性免疫因子，研究其免疫調(diào)控規(guī)律，深入研究蝦類(lèi)的免疫機(jī)制，探討提高其抗病力的方法與途徑，改良種質(zhì)，培養(yǎng)抗病品系，是解決當(dāng)前蝦類(lèi)工廠化養(yǎng)殖困擾的有效途徑。
　　甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)屬于非特異

2、性免疫系統(tǒng)，此系統(tǒng)主要是通過(guò)數(shù)量有限的模式識(shí)別蛋白識(shí)別異己后激活相關(guān)信號(hào)通路，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化抗微生物因子，激活體液免疫和細(xì)胞免疫，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)外來(lái)異物的全面防御。非特異性免疫產(chǎn)生的免疫防御因子主要有各類(lèi)識(shí)別因子、抗菌肽、抗病毒因子、細(xì)胞激活因子、凝集素、溶血素、凝血因子和具有免疫功能作用的各類(lèi)酶如溶菌酶、氧化酶類(lèi)、一氧化氮合酶等。對(duì)甲殼動(dòng)物Imd信號(hào)通路的研究源于果蠅和家蠶免疫防御信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)。果蠅的Imd信號(hào)通路參與抵御革蘭氏陰性菌的

3、侵染，介導(dǎo)先天性免疫防御反應(yīng)。此通路通過(guò)細(xì)胞的模式識(shí)別受體（PRRs）識(shí)別病原體特有的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)經(jīng)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，將信號(hào)傳遞到細(xì)胞核上的核轉(zhuǎn)錄因子Relish，啟動(dòng)通路下游免疫因子、抗菌肽、氧化酶等基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗菌作用。在已知中國(guó)明對(duì)蝦Relish基因情況下，本研究用同源克隆的方法獲得了與中國(guó)明對(duì)蝦位于同一條Imd信號(hào)通路上的Imd基因cDNA全長(zhǎng)序列，和脊尾白蝦此通路的Relish基因全長(zhǎng)，

4、并通過(guò)鰻弧菌刺激后中國(guó)明對(duì)蝦和脊尾白蝦Imd通路相關(guān)基因的表達(dá)及非特異性免疫因子的變化情況，初步了解 Imd通路相關(guān)基因在兩種養(yǎng)殖蝦類(lèi)免疫識(shí)別中的作用及兩種蝦類(lèi)在抗病力方面的差異。
　　根據(jù)genebank中已提交的節(jié)肢動(dòng)物門(mén)有關(guān)物種的Imd基因和Relish基因序列設(shè)計(jì)兼并引物得到核心片段，利用3'、5'RACE技術(shù)獲得兩端序列，經(jīng)拼接得到中國(guó)明對(duì)蝦Imd基因和脊尾白蝦Relish基因全長(zhǎng)。中國(guó)明對(duì)蝦Imd基因全長(zhǎng)784bp，其

5、中5'-UTR45bp，3'-UTR231bp，開(kāi)放閱讀框483bp，編碼160個(gè)氨基酸，分子量18123.64 D，理論等電點(diǎn)為8.022，屬于CDD超家族，含有一個(gè)位于C端的死亡結(jié)構(gòu)域，與凡納濱對(duì)蝦的IMD死亡結(jié)構(gòu)域基本一致，與果蠅的IMD蛋白及人類(lèi)腫瘤壞死因子的受體交互蛋白 R1P1具有較高的相似性。脊尾白蝦Relish基因全長(zhǎng)2141bp，開(kāi)放閱讀框1983bp，編碼660個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為75270 D。具有NF-kB核轉(zhuǎn)

6、錄因子特有的IPT結(jié)構(gòu)域，屬于RHD-n超家族成員。
　　將中國(guó)明對(duì)蝦和脊尾白蝦在養(yǎng)殖基地暫養(yǎng)一段時(shí)間后，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定注射鰻弧菌的濃度為107CFU/mL，隨后用鰻弧菌注射兩種蝦開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。記錄兩種蝦的死亡率，檢測(cè)中國(guó)明對(duì)蝦Imd基因和脊尾白蝦Relish基因的相對(duì)表達(dá)量，以及兩種蝦類(lèi)非特異性免疫酶活的變化來(lái)研究?jī)煞N蝦類(lèi)抗病力的情況及Imd信號(hào)通路相關(guān)基因在兩種蝦類(lèi)體內(nèi)的功能和相互關(guān)系。結(jié)果顯示，中國(guó)明對(duì)蝦在感染鰻弧菌早期死亡

7、速率較脊尾白蝦快，感染12小時(shí)后中國(guó)明對(duì)蝦死亡速率減慢，而脊尾白蝦死亡率仍成直線(xiàn)上升趨勢(shì)，直至48小時(shí)兩種蝦均不再出現(xiàn)死亡個(gè)體，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)中國(guó)明對(duì)蝦的累積死亡率要高于脊尾白蝦。鰻弧菌的刺激會(huì)導(dǎo)致Imd通路相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，但Relish基因在上調(diào)后逐漸恢復(fù)至原有水平。兩種蝦的非特異性免疫酶活力在受感染后均有不同程度的升高，中國(guó)明對(duì)蝦的非特異免疫酶活48小時(shí)后即與對(duì)照組差異不大，脊尾白蝦各免疫酶活力約96小時(shí)后恢復(fù)至正常值。這些結(jié)果表明