應(yīng)激對黃顙魚非特異性免疫細(xì)胞的影響.pdf

1、本研究首次系統(tǒng)地開展了應(yīng)激對黃顙魚非特異性免疫細(xì)胞影響的研究。采用光鏡和電鏡技術(shù)，對黃顙魚外周血細(xì)胞的組成與結(jié)構(gòu)，以及黃顙魚頭腎的組織發(fā)生與組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察；以血清皮質(zhì)醇為主要指標(biāo)，監(jiān)測了運(yùn)輸應(yīng)激對外周血白細(xì)胞百分比和功能的影響；采用Percoll連續(xù)密度梯度離心法分離出黃顙魚頭腎巨噬細(xì)胞，對其顯微、超顯微結(jié)構(gòu)與吞噬功能進(jìn)行了觀察，并進(jìn)一步研究了外源皮質(zhì)醇、巨噬細(xì)胞活化因子(MAF)、脂多糖(LPS)對頭腎巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的影

2、響；采用人工注射液體石蠟誘導(dǎo)腹腔炎癥的方法，觀察了黃顙魚腹腔滲出細(xì)胞的類型及炎癥過程中各類細(xì)胞相對數(shù)量和功能的變化特征，并進(jìn)一步研究了外源皮質(zhì)醇對腹腔滲出細(xì)胞數(shù)量與功能的影響。此外，還觀察和研究了外源皮質(zhì)醇對黃顙魚幼魚生長與外周血細(xì)胞數(shù)量的影響。 1.在血涂片上可鑒別出紅細(xì)胞、血栓細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜中粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，電鏡觀察可確認(rèn)這5種細(xì)胞類型。血涂片上還觀察到幼紅細(xì)胞及正在分裂的紅細(xì)胞。血栓細(xì)胞是數(shù)量僅次于紅細(xì)胞的血細(xì)胞，在

3、白細(xì)胞分類計數(shù)中占78％。淋巴細(xì)胞是核質(zhì)比最高的血細(xì)胞，在白細(xì)胞分類計數(shù)中占17.5％。一種與斑點(diǎn)叉尾鲴非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(NCC)相似的淋巴細(xì)胞被觀察到。嗜中粒細(xì)胞是所觀察到的唯一一種有粒細(xì)胞，是最大的白細(xì)胞，在白細(xì)胞分類計數(shù)中占3.7％。在嗜中粒細(xì)胞中只觀察到一種含有絲狀內(nèi)涵物的特殊顆粒，呈橢圓狀或桿狀。單核細(xì)胞在白細(xì)胞分類計數(shù)中不超過1％。 2.運(yùn)輸后的黃顙魚在最初4～7d內(nèi)，明顯的行為變化是停止攝食。所有的魚從第8d開

4、始恢復(fù)了攝食，從第15d開始適應(yīng)了日常管理活動。血液皮質(zhì)醇和血糖濃度在剛剛運(yùn)抵實(shí)驗循環(huán)系統(tǒng)(0d)及第1d，2d，3d的魚體內(nèi)顯著升高，至第7d已顯著下降，并在第21d，28d，35d穩(wěn)定在低水平上。外周血紅細(xì)胞數(shù)量沒有顯著變化。與第21d，28d，35d外周血白細(xì)胞的各參數(shù)值相比，淋巴細(xì)胞百分比在第3d，7d顯著減少，嗜中粒細(xì)胞百分比在0d，1d，2d，3d顯著升高，吞噬細(xì)胞吞噬百分比和吞噬指數(shù)在第7d，14d顯著降低。以上結(jié)果顯示(

5、1)運(yùn)輸使黃顙魚成魚產(chǎn)生典型的應(yīng)激反應(yīng)；(2)運(yùn)輸應(yīng)激導(dǎo)致黃顙魚成魚外周血淋巴細(xì)胞和嗜中粒細(xì)胞百分比的顯著改變和外周血白細(xì)胞吞噬功能的抑制；(3)運(yùn)輸應(yīng)激后的池養(yǎng)黃顙魚成魚在本文使用的實(shí)驗循環(huán)系統(tǒng)中充分恢復(fù)和馴化所需的最少時間是3周。 3.出膜后1d，頭腎僅由腎小管組成；出膜后2d，頭腎小管間出現(xiàn)未分化的細(xì)胞團(tuán)；出膜后7d，頭腎小管間出現(xiàn)淋巴細(xì)胞團(tuán)；此后淋巴細(xì)胞及造血細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多；出膜后26d至43d，腎小管逐漸萎縮直至完

6、全消失，頭腎完成由排泄器官向淋巴器官的轉(zhuǎn)變。黃顙魚頭腎不具有被膜，含豐富的靜脈血管、血竇以及處于不同發(fā)育時期的各類免疫細(xì)胞。腎上腺組織細(xì)胞分布于頭腎門靜脈以及頭腎組織中靜脈管周邊。黃顙魚幼魚頭腎所含酸性顆粒細(xì)胞較成魚頭腎豐富，黃顙魚成魚頭腎則具有較多的黑色素巨噬細(xì)胞，且常常在血管附近聚集形成黑色素巨噬細(xì)胞中心。黃顙魚頭腎免疫細(xì)胞的主要超微特征如下：細(xì)胞核質(zhì)比和線粒體數(shù)量在淋巴細(xì)胞中差異較大。一種粒細(xì)胞及其所含特殊顆粒與外周血嗜中粒細(xì)胞相

7、同；另一種粒細(xì)胞及其所含特殊顆粒與其他研究報道的魚類嗜酸性顆粒細(xì)胞(EGC)或肥大細(xì)胞相同。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都含有豐富的溶酶體及線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，后者則根據(jù)功能狀態(tài)的不同含有大小數(shù)量不等的吞噬泡。黑色素巨噬細(xì)胞含有極不規(guī)則的顆粒，顆粒具指紋特征。 4.每尾黃顙魚可分離出1.2-1.6mL 濃度為1×10<'7>cells/mL的高純度頭腎巨噬細(xì)胞；培養(yǎng)3h-18h后，貼壁純化的頭腎巨噬細(xì)胞達(dá)到95-98％；分離培養(yǎng)的

8、頭腎巨噬細(xì)胞具有巨噬細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，對福爾馬林滅活金黃色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率達(dá)95％以上。PMA刺激分離的頭腎巨噬細(xì)胞產(chǎn)生顯著的呼吸爆發(fā)活動。在較高濃度和較長作用時間情況下，外源皮質(zhì)醇對黃顙魚體內(nèi)外頭腎巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)均產(chǎn)生抑制作用。 5.采用ConA(10μg/mL)與PMA(10ng/mL)聯(lián)合刺激單尾黃顙魚頭腎白細(xì)胞所制備的含巨噬細(xì)胞活化因子(MAF)上清液經(jīng)1：4稀釋后與頭腎巨噬細(xì)胞孵育24h，能顯著提高細(xì)

9、胞的呼吸爆發(fā)活動。濃度分別為12.5、25、50μg/mL的LPS與頭腎巨噬細(xì)胞孵育24h，對細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活動都有顯著的促進(jìn)作用，且濃度越高促進(jìn)作用越顯著。 6.腹腔注射液體石蠟后黃顙魚腹腔滲出細(xì)胞主要包括嗜中粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性顆粒細(xì)胞(EGC)。注射后2d，腹腔滲出細(xì)胞以嗜中性粒細(xì)胞為主(占嗜中粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞總數(shù)的61±1.1％)，注射后6d、10d則以巨噬細(xì)胞為主(在嗜中粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和EGC分類計數(shù)中分別占77

10、.8±2.8％和82.3±1.1％)，注射后6d出現(xiàn)EGC，隨后數(shù)量逐漸增加。炎癥過程中吞噬細(xì)胞(包括腹腔滲出嗜中粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)對福爾馬林滅活金黃色葡萄球菌(F-SA)的吞噬率和硝基四氮唑藍(lán)(NBT)反應(yīng)陽性細(xì)胞率逐漸上升。皮質(zhì)醇混飼投喂使注射液體石蠟后6d腹腔滲出巨噬細(xì)胞百分比和吞噬細(xì)胞的吞噬率顯著下降，EGC百分比顯著上升。 7.外源皮質(zhì)醇混飼投喂(100mg/kg飼料)5周使黃顙魚幼魚增重顯著受阻，使外周血白細(xì)胞數(shù)量顯