1：亮氨酸經(jīng)PDX-1影響胰島β細胞功能研究;2：腺苷A2a受體在甲狀腺細胞的表達及對血管內(nèi)皮生長因子作用研究.pdf

1、論文1：亮氨酸經(jīng)PDX-1影響胰島β細胞功能研究 研究背景： 我們的實驗旨在研究長期高濃度亮氨酸培養(yǎng)對葡萄糖刺激的胰島素釋放和胰島素含量的影響，并且進一步研究其相關機制。 目的： 1.觀察長期亮氨酸培養(yǎng)對大鼠胰島β細胞株的胰島素釋放功能和胰島素含量的影響。 2.觀察長期亮氨酸對DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6細胞中PDX-1、GCK/GLUT2 mRNA表達的影響，探討可能的機制。

2、3.觀察長期亮氨酸是否通過通路影響高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 研究方法： 1.DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6胰島細胞株的培養(yǎng)和分組：RPMI1640培養(yǎng)PDX-1＃6細胞株與PDX-1不表達的PDX-1＃28細胞，加以強力霉素，使PDX-1過表達以及不表達。DN-PDX-1＃28 and PDX-1＃6細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此外，還需添加100μg/ml潮霉素，100μg/ml G418和

3、500 ng/ml的強力霉素。DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6細胞分別在40mM亮氨酸或者500 ng/ml的強力霉素中培養(yǎng)。 2.葡萄糖刺激的胰島素釋放功能以及胰島素含量的測定與評價：細胞種于24孔板中，分組處理后，在葡萄糖濃度為3.3 mM、27.8 mM的KRB緩沖液分別孵育20min，收集上清，放射免疫方法測定分泌的胰島素水平分別為基礎胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌。 3.PDX-1、GCK、GLUT2

4、的mRNA檢測：在DN-PDX-1＃28和PDX-1＃6細胞上，Real-time PCR檢測PDX-1、GCK、GLUT2mRNA的表達。 結(jié)果： 1、胰島素釋放和胰島素含量 ①在DN-PDX-1＃28細胞中，與正常對照組相比，單純亮氨酸組和單純強力霉素組分別顯著降低高糖刺激的胰島素分泌36％和84％，分別降低胰島素含量23％和62％。與單純亮氨酸組相比，強力霉素與亮氨酸共同培養(yǎng)組顯著降低高糖刺激的胰島素分泌6

5、7％，降低胰島素含量44％。 ②在PDX-1＃6細胞中，與正常對照組相比，單純亮氨酸組顯著降低高糖刺激的胰島素分泌26％，降低胰島素含量25％；單純強力霉素組顯著增加高糖刺激的胰島素分泌20％，增加胰島素含量21％。然而，與單純亮氨酸組相比，強力霉素與亮氨酸共同培養(yǎng)組顯著增加高糖刺激的胰島素分泌36％，增加胰島素含量21％。 2、PDX.1、GCK、GLUT2mRNA表達 ①在DN.PDX-I＃28細胞中，與對照

6、組相比，單純亮氨酸組顯著降低PDX.1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平；單純強力霉素組也顯著降低PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平；與單純亮氨酸組相比，強力霉素與亮氨酸共同培養(yǎng)組顯著降低PDX.1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平。 ②在PDX-1＃6細胞中，與對照組相比，單純亮氨酸組顯著降低PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平；單純強力霉素組也顯著增強PDX-1、GC

7、K mRNA和GLUT2 mRNA水平；與單純亮氨酸組相比，強力霉素與亮氨酸共同培養(yǎng)組顯著增強PDX-1、GCK mRNA和GLUT2 mRNA水平。 結(jié)論： 長期40mM濃度亮氨酸在轉(zhuǎn)錄水平通過降調(diào)β細胞PDX-1以及其下游因子GCK與GLUT2 mRNA表達，最終抑制高糖刺激的胰島素釋放以及胰島素含量。 論文2：腺苷受體A2aR在甲狀腺細胞的表達及對血管內(nèi)皮生長因子作用研究 目的： 1、確定A

8、2aR在大鼠甲狀腺細胞中的基因和蛋白表達； 2、通過A2aR激動劑或TSH刺激甲狀腺細胞，觀察A2aR和TSHR基因表達的變化，初步探討A2aR和TSHR的關系； 3、通過A2aR激動劑、A2aR阻斷劑、TSH或IGF-1刺激甲狀腺細胞，觀察VEGF基因和細胞內(nèi)外蛋白表達的變化；以及通過A2aR激動劑、A2aR阻斷劑刺激甲狀腺細胞，觀察IGF-1基因和細胞內(nèi)外蛋白表達的變化，探討A2aR對VEGF和IGF-1影響。

9、 研究方法： 1、甲狀腺細胞培養(yǎng)：Coon's改良的Ham’s F12培養(yǎng)液中加入六種激素-促甲狀腺激素10 mU/ml、胰島素10μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5μg/ml、氫化考的松5 ng/ml、生長抑素10 ng/ml、甘氨酸-組氨酸-亮氨酸10 ng/ml及5％胎牛血清，即配成甲狀腺細胞培養(yǎng)液，稱為6H。待甲狀腺細胞在培養(yǎng)皿中長至80％～85％時，PBS洗兩遍，然后以4H培養(yǎng)基為對照加入不同的處理作用48d小時。另外，原代培養(yǎng)

10、的大鼠神經(jīng)元細胞作為A2aRmRNA表達的陽性對照。 2、采用RT-PCR檢測A2aR、TSHR、IGF-1和VEGF各亞型mRNA水平變化。 3、采用免疫熒光反應檢測A2aR在甲狀腺細胞中表達的位置。 4、采用免疫沉淀-Western blot檢測A2aR和IGF-1蛋白水平。 5、采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法檢測甲狀腺細胞內(nèi)外VEGF蛋白水平。 結(jié)果： 1、A2aR在甲狀腺細胞中的表達：在

11、甲狀腺細胞和陽性對照神經(jīng)元細胞中都能擴增出A2aRmRNA140bp大小的片段。與正常對照組相比，1.1μM CGS21680能上調(diào)甲狀腺細胞A2aR的mRNA水平，而10mU/ml TSH下調(diào)其mRNA水平（P<0.05）；采用了免疫共沉淀-Western blots的方法進行半定量實驗結(jié)果顯示在甲狀腺細胞中CGS21680可以輕度調(diào)節(jié)A2aR蛋白水平（P>0.05），采用了免疫熒光的方法進行定位實驗結(jié)果顯示A2aR蛋白表達在甲狀腺細

12、胞的細胞膜中。 2、TSHR在甲狀腺細胞中的mRNA的表達：與正常對照組相比，10 mU/ml TSH下調(diào)30.5％（P<0.05），而1.0μM CGS21680上調(diào)1.35倍（P<0.05）甲狀腺細胞TSHR的mRNA水平，并且都呈劑量依賴性。 3、VEGF各亞型在甲狀腺細胞中的轉(zhuǎn)錄表達：正常培養(yǎng)甲狀腺細胞中可以擴增出4個VEGF亞型：VEGF188，VEGF164，VEGF144和VEGF120，其中，VEGF12

13、0和VEGF164是主要成分。 CGS21680對VEGF亞型mRNA的影響：與正常對照組相比，CGS21680明顯上調(diào)VEGF188和VEGF164的表達（P<0.05）；TSH對VEGF亞型mRNA的影響：與正常對照組相比，TSH明顯下調(diào)VEGF188和VEGF164的表達（P<0.05）；IGF-1對VEGF亞型mRNA的影響：與正常對照組相比，IGF-1明顯上調(diào)VEGF164和VEGF120的表達（P<0.05）。

14、 4、VEGF蛋白在甲狀腺細胞中的表達： ①首先對細胞內(nèi)外的VEGF蛋白量進行相關分析：VEGF蛋白量細胞外量是細胞內(nèi)量的22.3倍，相關分析顯示兩者之間呈正相關關系，相關系數(shù)為0.978。 ②A2aR對VEGF蛋白表達的影響：CGS21680刺激甲狀腺細胞后，細胞內(nèi)外VEGF蛋白含量都明顯增加，且隨著CGS21680刺激濃度的增高；相反，ZM241385刺激甲狀腺細胞后，細胞內(nèi)外VEGF蛋白含量都明顯下調(diào)，且隨著Z

15、M241385刺激濃度的增高，VEGF表達明顯下調(diào)；ZM241385可以抑制CGS21680引起的VEGF上調(diào)表達。以上說明VEGF的蛋白表達與A2aR的活性變化呈劑量依賴性； ③TSH和IGF-1對VEGF蛋白表達的影響：加入10 mU/ml TSH后，與對照組相比，細胞外VEGF含量下降16.9％（P<0.05）；而加入50ng/ml IGF-l后，細胞外VEGF含量升高39.0％（P<0.05）。 5、TSH和A2

16、aR對IGF-1的影響：加入10 mU/ml TSH后，IGF-1mRNA水平下調(diào)。而A2aR激動劑CGS21680刺激甲狀腺細胞后，與對照組相比，IGF-1 mRNA和蛋白水平上調(diào)，阻斷劑ZM241385可以抑制IGF-1蛋白水平。 結(jié)論： 1、腺苷受體A2aR在甲狀腺細胞FRTL-5中存在mRNA和蛋白的表達，并且該受體蛋白表達在細胞膜中。 2、腺苷受體A2aR的激動劑CGS21680上調(diào)甲狀腺細胞A2aR、

17、TSHR、VEGF亞型（主要是VEGF164）和IGF-1mRNA水平的表達；相反TSH受體的配體TSH下調(diào)以上三個基因的mRNA水平表達。本研究結(jié)果表明，同為G蛋白偶聯(lián)受體的A2aR和TSHR之間可能存在某種協(xié)同關聯(lián)。 3、A2aR調(diào)節(jié)甲狀腺細胞VEGF和IGF-1的mRNA和蛋白水平的表達；IGF-1上調(diào)甲狀腺細胞VEGF的mRNA（主要是VEGF164）和蛋白水平的表達，這提示在甲狀腺細胞內(nèi)A2aR上調(diào)VEGF表達可能與I