紫外線誘導的細胞DNA損傷模式研究.pdf

1、DNA是儲存與傳遞遺傳信息的重要生物大分子，其分子的完整性對生物體生命活動至關重要。過量的紫外輻射可引起細胞內DNA堿基發(fā)生突變、DNA斷裂、DNA—DNA交聯(lián)、DNA—蛋白交聯(lián)以及染色體畸變等損傷。DNA損傷若不能及時修復，細胞將發(fā)生癌變或死亡。不同劑量紫外線對細胞DNA的損傷模式不同，可能引起的修復機制有差別。因此，研究不同劑量紫外線誘導細胞DNA損傷模式的變化對于進一步探討DNA損傷修復機制，預防某些修復缺陷性疾病的發(fā)生有一定的現(xiàn)

2、實意義，并對遺傳學、腫瘤學、衰老學和毒理學等研究具有一定的理論價值。 本文采用彗星電泳法檢測紫外線對細胞DNA損傷的效應以及不同種類細胞的敏感性差異；應用彗星電泳、DCFH—DA熒光探針檢測法以及NAC抗氧化劑等方法檢測了低劑量紫外線對細胞DNA的損傷；采用流式細胞儀、MTT、細胞計數(shù)等方法檢測了中等劑量UVC對細胞DNA的損傷；應用原子力顯微鏡和彗星電泳方法檢測了高劑量紫外線對細胞DNA的損傷。 主要內容：

3、 1、檢測相同劑量不同功率紫外線誘導的細胞DNA損傷。彗星電泳和HE染色的實驗結果表明：離體培養(yǎng)的K562細胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞經(jīng)不同功率相同劑量的UVC或UVB照射后，DNA損傷程度無差異。 2、檢測不同波長UV照射白血病K562細胞DNA的損傷。彗星電泳的檢測結果顯示：照射劑量0～440J/m2的UVA不會對K562細胞DNA造成即時性損傷；UVB、UVC可以造成K562細胞DNA的損傷，并在一定范圍內呈現(xiàn)照射劑量依

4、賴效應。UVB在20～320J/m2照射劑量下與細胞DNA損傷的相關性為0.9344和0.956；UVC在3.2～180J/m2照射劑量下與細胞DNA損傷的相關性為0.9841和0.994；相同照射劑量下UVC對細胞DNA的損傷程度顯著高于UVB。 3、檢測了不同細胞對UVC的敏感性。不同腫瘤細胞應答UVC損傷的敏感性存在差異：SMMC-7721細胞的敏感性高于HepG2細胞。正常細胞與腫瘤細胞應答UVC損傷的敏感性也存在差異

5、：hepa1-6細胞的敏感性高于原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞。不同活化程度的正常細胞對UVC損傷的敏感性不同：活化淋巴細胞比靜息淋巴細胞敏感性高。 4、檢測了不同周期時相的K562細胞對于UVC的敏感性：彗星檢測發(fā)現(xiàn)G2期的細胞最為敏感，其次為M期、S期和G1期。 5、K562細胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞在低劑量UVB和UVC照射后經(jīng)孵育，彗星電泳能夠檢測出即時檢測不能發(fā)現(xiàn)的細胞DNA損傷。低劑量UV照射后，胞內ROS含量升高

6、，并在細胞孵育后含量降低。實驗組中加入ROS清除劑NAC后可以降低細胞DNA的損傷。這提示低劑量UV照射造成的延時損傷可能以ROS引發(fā)的損傷修復有關。 6、K562細胞經(jīng)中等劑量(60J/m2)UVC照射后的DNA損傷在20h內修復或消失。UVC致細胞DNA損傷具有延時效應。UVC照射細胞后，隨孵育時間的延長細胞DNA損傷程度加劇，2小時后DNA損傷達到最大值，孵育4小肘后DNA損傷程度開始下降，孵育至20小時損傷程度恢復至未

7、照射細胞的水平。細胞計數(shù)的結果表明，照射后12h細胞數(shù)目降至最低，而后細胞數(shù)目開始增加。UVC照射使K562細胞周期被阻滯于G1/S期或G2/M期。 7、優(yōu)化了用于原子力顯微鏡觀察的細胞DNA提取系統(tǒng)。建立了用原子力顯微鏡觀察DNA的陽性模型。 8、K562細胞經(jīng)高劑量UV照射后的DNA損傷嚴重。高劑量UVC照射后，K562細胞DNA損傷嚴重，發(fā)生斷裂、交聯(lián)(DNA鏈間或鏈內)，K562細胞增殖能力減弱。高劑量UVB

8、照射后，DNA小片段交聯(lián)在一起。 結論：相同劑量不同功率的UVC或UVB照射后，DNA損傷程度無差異。UV造成的細胞DNA損傷與照射波段、劑量密切相關。UVC對細胞DNA的損傷能力大于UVB。UVB、UVC造成的K562細胞DNA的損傷在一定范圍內呈現(xiàn)照射劑量依賴效應。我們得到UVB、UVC在一定劑量范圍與DNA損傷之間的線性方程。UBV：y=0.1196x-0.0534，R2=0.9344或y=0.0814x-0.0627，

9、R2=0.956。UVC：y=0.2018x+0.9053，R2=0.9841或y=0.1251x+0.6914，R2=0.994。不同細胞應答UVC損傷的敏感性存在差異，這可能與細胞的增殖速度不同有關；周期時相的細胞對UVC的敏感性不同進一步證明了這一點。 不同劑量紫外線誘導的細胞DNA損傷有不同的模式。實驗發(fā)現(xiàn)低劑量UVB與UVC照射K562細胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細胞后經(jīng)孵育，彗星電泳能夠檢測出即時檢測不能發(fā)現(xiàn)的細胞DNA

10、損傷并且細胞內ROS含量升高，進一步實驗加入ROS清除劑NAC后可以降低細胞DNA的損傷，表明延時檢測到的DNA損傷與ROS有一定關系。中等劑量UVC對K562細胞DNA的損傷具有延時效應并且在20小時內可以恢復。此劑量下的UVC照射后細胞周期被阻滯在G1/S期或G2/M期。應用原子力顯微鏡直接觀測到高劑量UVC照射細胞后，K562細胞DNA損傷嚴重，發(fā)生斷裂、交聯(lián)。與UVB相比，UVC照射后細胞DNA鏈的直徑變細，DNA鏈的交聯(lián)可能多