紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷模式研究.pdf

1、DNA是儲(chǔ)存與傳遞遺傳信息的重要生物大分子，其分子的完整性對(duì)生物體生命活動(dòng)至關(guān)重要。過(guò)量的紫外輻射可引起細(xì)胞內(nèi)DNA堿基發(fā)生突變、DNA斷裂、DNA—DNA交聯(lián)、DNA—蛋白交聯(lián)以及染色體畸變等損傷。DNA損傷若不能及時(shí)修復(fù)，細(xì)胞將發(fā)生癌變或死亡。不同劑量紫外線對(duì)細(xì)胞DNA的損傷模式不同，可能引起的修復(fù)機(jī)制有差別。因此，研究不同劑量紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞DNA損傷模式的變化對(duì)于進(jìn)一步探討DNA損傷修復(fù)機(jī)制，預(yù)防某些修復(fù)缺陷性疾病的發(fā)生有一定的現(xiàn)

2、實(shí)意義，并對(duì)遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、衰老學(xué)和毒理學(xué)等研究具有一定的理論價(jià)值。 本文采用彗星電泳法檢測(cè)紫外線對(duì)細(xì)胞DNA損傷的效應(yīng)以及不同種類細(xì)胞的敏感性差異；應(yīng)用彗星電泳、DCFH—DA熒光探針檢測(cè)法以及NAC抗氧化劑等方法檢測(cè)了低劑量紫外線對(duì)細(xì)胞DNA的損傷；采用流式細(xì)胞儀、MTT、細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法檢測(cè)了中等劑量UVC對(duì)細(xì)胞DNA的損傷；應(yīng)用原子力顯微鏡和彗星電泳方法檢測(cè)了高劑量紫外線對(duì)細(xì)胞DNA的損傷。 主要內(nèi)容：

3、 1、檢測(cè)相同劑量不同功率紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷。彗星電泳和HE染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：離體培養(yǎng)的K562細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞經(jīng)不同功率相同劑量的UVC或UVB照射后，DNA損傷程度無(wú)差異。 2、檢測(cè)不同波長(zhǎng)UV照射白血病K562細(xì)胞DNA的損傷。彗星電泳的檢測(cè)結(jié)果顯示：照射劑量0～440J/m2的UVA不會(huì)對(duì)K562細(xì)胞DNA造成即時(shí)性損傷；UVB、UVC可以造成K562細(xì)胞DNA的損傷，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)照射劑量依

4、賴效應(yīng)。UVB在20～320J/m2照射劑量下與細(xì)胞DNA損傷的相關(guān)性為0.9344和0.956；UVC在3.2～180J/m2照射劑量下與細(xì)胞DNA損傷的相關(guān)性為0.9841和0.994；相同照射劑量下UVC對(duì)細(xì)胞DNA的損傷程度顯著高于UVB。 3、檢測(cè)了不同細(xì)胞對(duì)UVC的敏感性。不同腫瘤細(xì)胞應(yīng)答UVC損傷的敏感性存在差異：SMMC-7721細(xì)胞的敏感性高于HepG2細(xì)胞。正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞應(yīng)答UVC損傷的敏感性也存在差異

5、：hepa1-6細(xì)胞的敏感性高于原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞。不同活化程度的正常細(xì)胞對(duì)UVC損傷的敏感性不同：活化淋巴細(xì)胞比靜息淋巴細(xì)胞敏感性高。 4、檢測(cè)了不同周期時(shí)相的K562細(xì)胞對(duì)于UVC的敏感性：彗星檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G2期的細(xì)胞最為敏感，其次為M期、S期和G1期。 5、K562細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞在低劑量UVB和UVC照射后經(jīng)孵育，彗星電泳能夠檢測(cè)出即時(shí)檢測(cè)不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞DNA損傷。低劑量UV照射后，胞內(nèi)ROS含量升高

6、，并在細(xì)胞孵育后含量降低。實(shí)驗(yàn)組中加入ROS清除劑NAC后可以降低細(xì)胞DNA的損傷。這提示低劑量UV照射造成的延時(shí)損傷可能以ROS引發(fā)的損傷修復(fù)有關(guān)。 6、K562細(xì)胞經(jīng)中等劑量(60J/m2)UVC照射后的DNA損傷在20h內(nèi)修復(fù)或消失。UVC致細(xì)胞DNA損傷具有延時(shí)效應(yīng)。UVC照射細(xì)胞后，隨孵育時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞DNA損傷程度加劇，2小時(shí)后DNA損傷達(dá)到最大值，孵育4小肘后DNA損傷程度開始下降，孵育至20小時(shí)損傷程度恢復(fù)至未

7、照射細(xì)胞的水平。細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果表明，照射后12h細(xì)胞數(shù)目降至最低，而后細(xì)胞數(shù)目開始增加。UVC照射使K562細(xì)胞周期被阻滯于G1/S期或G2/M期。 7、優(yōu)化了用于原子力顯微鏡觀察的細(xì)胞DNA提取系統(tǒng)。建立了用原子力顯微鏡觀察DNA的陽(yáng)性模型。 8、K562細(xì)胞經(jīng)高劑量UV照射后的DNA損傷嚴(yán)重。高劑量UVC照射后，K562細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重，發(fā)生斷裂、交聯(lián)(DNA鏈間或鏈內(nèi))，K562細(xì)胞增殖能力減弱。高劑量UVB

8、照射后，DNA小片段交聯(lián)在一起。 結(jié)論：相同劑量不同功率的UVC或UVB照射后，DNA損傷程度無(wú)差異。UV造成的細(xì)胞DNA損傷與照射波段、劑量密切相關(guān)。UVC對(duì)細(xì)胞DNA的損傷能力大于UVB。UVB、UVC造成的K562細(xì)胞DNA的損傷在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)照射劑量依賴效應(yīng)。我們得到UVB、UVC在一定劑量范圍與DNA損傷之間的線性方程。UBV：y=0.1196x-0.0534，R2=0.9344或y=0.0814x-0.0627，

9、R2=0.956。UVC：y=0.2018x+0.9053，R2=0.9841或y=0.1251x+0.6914，R2=0.994。不同細(xì)胞應(yīng)答UVC損傷的敏感性存在差異，這可能與細(xì)胞的增殖速度不同有關(guān)；周期時(shí)相的細(xì)胞對(duì)UVC的敏感性不同進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。 不同劑量紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷有不同的模式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低劑量UVB與UVC照射K562細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞后經(jīng)孵育，彗星電泳能夠檢測(cè)出即時(shí)檢測(cè)不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞DNA

10、損傷并且細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加入ROS清除劑NAC后可以降低細(xì)胞DNA的損傷，表明延時(shí)檢測(cè)到的DNA損傷與ROS有一定關(guān)系。中等劑量UVC對(duì)K562細(xì)胞DNA的損傷具有延時(shí)效應(yīng)并且在20小時(shí)內(nèi)可以恢復(fù)。此劑量下的UVC照射后細(xì)胞周期被阻滯在G1/S期或G2/M期。應(yīng)用原子力顯微鏡直接觀測(cè)到高劑量UVC照射細(xì)胞后，K562細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重，發(fā)生斷裂、交聯(lián)。與UVB相比，UVC照射后細(xì)胞DNA鏈的直徑變細(xì)，DNA鏈的交聯(lián)可能多