扇貝多肽經(jīng)由HF1-HSP70-ROS、NO-JNK通路抑制紫外線A誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:復(fù)制8J/cm2UVA誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡模型,建立iNOS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞模型,從熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)/熱休克蛋白70(HSP70)/活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)、c-Jun氨基術(shù)端激酶(JNK)角度,研究扇貝多肽(Polypeptide fromChlamys farreri,PCF)抑制UVA引起的HaCaT細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　 方法:復(fù)制8J/cm2UVA誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡模型。利

2、用陽離子脂質(zhì)體(LipefectimeTM2000)法建立iNOS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為:對照組、UVA模型組、UVA+iNOS特異性抑制劑1 mmol/L SMT組、UVA+ROS清除劑0.5 mmol/L NAC(N-acetyl-L-cysteine,NAC)組、UVA+HSP70轉(zhuǎn)錄活性抑制劑50μmol/L槲皮素組、UVA+黃嘌呤氧化酶(XO)抑制劑100μmol/L別嘌呤醇(Oxy)組、UVA+5.69 mm

3、ol·L-1PCF組、UVA+2.84 mmol·L-1PCF組、UVA+1.42 mmol·L-1PCF組。Honechst33258熒光染色觀察細(xì)胞凋亡率;蛋白質(zhì)印跡法檢測磷酸化HSF1(p-HSF1)、HSP70、iNOS在UVA輻射損傷HaCaT細(xì)胞后于細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)時(shí)(1、3、6、12、18、24 h)變化及6 h后JNK、磷酸化JNK(p-JNK)的蛋白表達(dá)量;Real-Time PCR檢測HSF1 mRNA、HSP70 mRN

4、A、XO mRNA的表達(dá);以電子自旋共振法(ESR)同時(shí)檢測UVA照射后細(xì)胞內(nèi)NO與ROS的經(jīng)時(shí)變化及Oxy、SMT、PCF對NO釋放量的影響。
　　 結(jié)果:Honechst33258熒光染色證實(shí)成功復(fù)制8J/cm2UVA損傷HaCaT細(xì)胞后18 h的凋亡模型,1.42～5.69 mmol/L劑量范圍內(nèi)的PCF與1 mmol/LSMT、0.5 mmol/L NAC均能夠明顯抑制UVA引起的HaCaT細(xì)胞凋亡(P＜0.05);蛋白

5、經(jīng)時(shí)變化顯示P-HSF1于8J/cm2UVA照射后3 h達(dá)高峰(P＜0.05)而HSP70表達(dá)高峰出現(xiàn)于6 h(P＜0.05);UVA輻射前預(yù)先加入槲皮素使p-JNK、iNOS、XO的表達(dá)量升高,NO、ROS釋放量增加且細(xì)胞凋亡率增加(P＜0.05);1.42～5.69 mmol·L-1劑量范圍內(nèi)的PCF可劑量依賴性抑制提高HSF1的轉(zhuǎn)錄活性、增加HSP70蛋白和HSP70 mRNA的表達(dá)、抑制ROS和NO的生成、降低JNK的活化(P＜