我國(guó)新生隱球菌的基因分型和分子流行病學(xué)分析.pdf

1、本研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR 指紋法、PCR 特異擴(kuò)增、PCR-RFLP、MLST、系統(tǒng)發(fā)育研究來(lái)分析我國(guó)新生隱球菌臨床分離株的分子特征，旨在闡明我國(guó)新生隱球菌基因型和交配型在臨床中的分布及其分子流行病學(xué)特征。主要工作包括以下三個(gè)部分： 一、PCR-RFLP和PCR 指紋法在新生隱球菌基因分型中的應(yīng)用與比較 目的：探討針對(duì)結(jié)構(gòu)基因g6341的PCR－RFLP 方法在新生隱球菌基因分型中的應(yīng)用價(jià)值，并與PCR 指紋分

2、型法進(jìn)行比較。方法：以野生型噬菌體M13 中針對(duì)小衛(wèi)星DNA的核心序列為單引物，對(duì)受試的新生隱球菌進(jìn)行PCR 指紋分型。選擇結(jié)構(gòu)基因g6341 進(jìn)行PCRRFLP分析，在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，篩選合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行RFLP 分析，并與PCR 指紋法進(jìn)行比較。G6341 基因擴(kuò)增片段測(cè)序，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，研究各主要基因型間的親緣關(guān)系。結(jié)果：多位點(diǎn)基因序列分析表明，結(jié)構(gòu)基因g6341 可作為RFLP 分析的合適靶點(diǎn)。對(duì)76 株新生隱

3、球菌的基因分型結(jié)果顯示，針對(duì)g6341的PCR-RFLP 方法與PCR 指紋法結(jié)果一致。分析g6341 基因部分序列得出，8 種主要基因型菌株相互間的同源性在84％～97％之間，同一主要基因型菌株的同源性在99％～100％之間。分子發(fā)育樹(shù)中，VNI－VNIV 基因型、VGI－VGIV 基因型分別聚在一類。結(jié)論：針對(duì)結(jié)構(gòu)基因g6341的PCR-RFLP 方法可作為新生隱球菌分子分型的有效工具，對(duì)g6341 基因的序列分析可揭示不同菌株間的

4、遺傳進(jìn)化關(guān)系。 二、國(guó)內(nèi)110 株新生隱球菌臨床株變種、基因型和交配型分析 目的：對(duì)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)的新生隱球菌臨床株進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，分析其變種、基因型和交配型的構(gòu)成和分布。方法：1、PCR 指紋分型法：以野生型噬菌體M13 中針對(duì)小衛(wèi)星DNA的核心序列為單引物對(duì)模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將所有受試菌株鑒定到8 種主要基因型水平。2、利用變種和交配型特異性引物擴(kuò)增分型法，區(qū)分格魯比、新生和格特變種，同時(shí)鑒定α和a 交配型。

5、結(jié)果：110 株臨床株中，98株（89.1％）為格魯比變種，均為VNI 基因型和α交配型；9 株（8.2％）格特變種，包括VGI 基因型、α交配型8 株（7.3％）和VGII基因型、α交配型1 株（0.9％）；2 株（1.8％）為AD 雜合體，VNIII基因型，-/α和α/-交配型各1 株；1 株（0.9％）為新生變種，VNIV基因型和a 交配型。結(jié)論：我國(guó)新生隱球菌臨床株包含3 個(gè)變種和AD雜合體。與國(guó)外情況比較，相似的是國(guó)內(nèi)臨床株中

6、絕大部分為α交配型菌株，且格魯比變種中的VNI 基因型占了其中的大部分；但未發(fā)現(xiàn)VN II、VG III和VGIV 基因型菌株。 三、我國(guó)致病格特隱球菌的基因亞型分析 目的：分析我國(guó)致病格特隱球菌的基因型和基因亞型，探討其與世界范圍內(nèi)格特隱球菌的親緣關(guān)系和分子流行病學(xué)聯(lián)系。方法：擴(kuò)增國(guó)內(nèi)9 株格特隱球菌臨床株的3 個(gè)非連鎖位點(diǎn)即IGS1（基因內(nèi)間隔區(qū)）、PLB1（磷脂酶編碼基因）和GEF1（交配型位點(diǎn)內(nèi)基因）部分可變區(qū)片

7、段，檢索GenBank 上相應(yīng)位點(diǎn)的核酸序列信息，進(jìn)行多位點(diǎn)的序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析；選擇針對(duì)MF 基因(編碼性激素）的PCR 特異擴(kuò)增法鑒定交配型。結(jié)果：1、國(guó)內(nèi)8 株VGI 基因型和α交配型菌株在IGS1、PLB1和GEF1 位點(diǎn)上的所測(cè)序列與以菌株WM276為代表的一種基因亞型完全相同；國(guó)內(nèi)首株VGII 基因型和α交配型菌株在IGS1和PLB1 位點(diǎn)所測(cè)序列與以菌株R272 為代表的一種基因亞型一致。2、針對(duì)GEF1 基因部分片段