PRRSV與HPS共感染作用及HPS毒力基因.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是一種豬上呼吸道的常在菌,能夠從健康豬的鼻、氣管和扁桃體中分離得到,在正常情況下不呈現(xiàn)臨床癥狀,但在特定條件下可侵入機(jī)體,從而引起豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等疾病。近幾年,隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；图s化的發(fā)展,該病以繼發(fā)的方式存在于各規(guī)?；i場(chǎng),并呈逐年上升趨勢(shì),增加了斷奶到保育階段仔豬的發(fā)病率及死亡率,給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已成為嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的重要細(xì)菌性疾病

2、之一。
　　近年來,對(duì)HPS的致病機(jī)理與毒力因子的研究更加受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視,但這些毒力因子是否與HPS的毒力密切相關(guān),還需要進(jìn)一步研究。明確HPS的致病機(jī)理及毒力因子對(duì)HPS的預(yù)防與治療具有重要意義。
　　為了深入了解HPS的血清型流行情況及該病與其他病原體的混合感染情況,從我國(guó)部分地區(qū)送檢的186份新鮮樣品中共分離鑒定得到57株HPS分離株,分離率為30.6％,其中血清4型和5型是該菌流行的優(yōu)勢(shì)血清型,HPS與PRRS

3、V混合感染所占比例最高。研究還發(fā)現(xiàn)該病春、秋、冬季的發(fā)病率要高于夏季,且多發(fā)于4~7周齡的保育豬。對(duì)16SrRNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多菌株在243-244位為CT,在256-258位為AAG,在417-421位為ACATA,這為HPS疫苗菌株血清型的篩選及該病的防治提供了重要的參考依據(jù)。
　　為了進(jìn)一步明確PRRSV與HPS的相互作用,選取32頭4周齡健康仔豬進(jìn)行攻毒試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)共感染組和HPS組仔豬體溫明

4、顯高于PRRSV組和對(duì)照組(P<0.05),而且共感染組在攻HPS后的1~3d體溫明顯高于HPS組(P<0.05)。HPS組比共感染組有更嚴(yán)重的纖維素性心包炎、腹膜炎癥狀。熒光定量PCR檢測(cè)各個(gè)臟器細(xì)菌含量,發(fā)現(xiàn)心臟和肺臟含菌量明顯高于其它組織,且心臟含菌量最高;共感染組含菌量明顯高于HPS組,陰性對(duì)照組無變化。試驗(yàn)結(jié)果說明, PRRSV能加快感染HPS豬只的死亡速度,對(duì)HPS有一定程度的協(xié)同增殖作用。
　　選取不同血清型的HPS

5、分離株對(duì)仔豬和BALB/c小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn),比較該菌對(duì)兩種動(dòng)物的致病性。結(jié)果表明,相同血清型的HPS分離株對(duì)仔豬和BALB/c小鼠的毒力一致,這為研究HPS分離株的毒力奠定了基礎(chǔ)。
　　采用抑制消減雜交的方法,使LC株(血清1型)與ZQ株(血清4型)中共有的基因片段得到有效的差減,而僅存在與LC株中的特異性表達(dá)基因得到特異性擴(kuò)增。利用克隆技術(shù),成功構(gòu)建HPS差減文庫,再通過斑點(diǎn)雜交技術(shù),得到差異片段,送測(cè)序后,經(jīng)同源序列分析獲得的

6、差異片段,主要以編碼限制性修飾系統(tǒng)、外膜蛋白、代謝相關(guān)蛋白、調(diào)節(jié)與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白、DNA合成相關(guān)蛋白、噬菌體相關(guān)蛋白為主,還有許多未知功能蛋白。通過PCR結(jié)合小鼠攻毒試驗(yàn),分析差異基因與HPS分離株的毒力的關(guān)系,進(jìn)一步確定了4個(gè)基因(hsdR,hsdS, gpT和ompP2)是HPS的毒力基因。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)HPS同一血清型的不同分離株的毒力存在相當(dāng)大差異,而且菌株的分離部位與毒力也存在一定的關(guān)系。本研究為進(jìn)一步探究HPS強(qiáng)毒力菌株和弱毒力菌

7、株之間的差異以及毒力基因的功能研究奠定了重要基礎(chǔ)。
　　選擇HPS的毒力基因ompP2和gpT,克隆至真核表達(dá)載體,成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCI-neo-ompP2和pCI-neo-gpT,轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞,觀察24h、36h和48h細(xì)胞形態(tài)的變化,兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,均能引起細(xì)胞死亡,通過Western-blot方法鑒定不同時(shí)間段蛋白的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加蛋白的表達(dá)量也逐漸增加,這初步確定ompP2基因和gpT基因與HPS毒

8、力有關(guān),為下一步構(gòu)建HPS缺失株提供了參考依據(jù)。
　　利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建HPS LC株的缺失株LCΔompP2株,并對(duì)野生型菌株和缺失株的生長(zhǎng)特性和毒力進(jìn)行了研究,結(jié)果證實(shí)ompP2基因的敲除對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成了一定的影響,而且ompP2缺失株對(duì)仔豬的毒力明顯減弱,說明ompP2的確是HPS的毒力基因。本研究通過構(gòu)建HPS缺失株LCΔompP2,為深入探討ompP2基因的功能,特別是野生型菌株與缺失株LCΔompP2在粘附方面