Tbx1基因表達(dá)調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)神經(jīng)嵴細(xì)胞的發(fā)育及其與視黃酸信號(hào)的關(guān)系.pdf

1、DiGeorge綜合征(DGS)是人類(lèi)最常見(jiàn)的染色體缺失綜合征之一，活產(chǎn)嬰兒發(fā)病率約1/4000-5000。由于DGS累及組織器官較多，對(duì)患者的危害較大，特別是復(fù)雜心血管畸形，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。因此，研究DGS的發(fā)病機(jī)理，探索預(yù)防策略十分重要。
　　近年來(lái)研究表明，DGS的發(fā)生與tbx1基因單倍劑量不足(haploinsufficiency)、神經(jīng)嵴細(xì)胞(Neural crest cells，NCCs)發(fā)育異常等多

2、種因素有關(guān)。鑒于此，我們研究了兩者之間的關(guān)系。NCCs中tbx1基因不表達(dá)，可能存在介導(dǎo)tbx1基因作用的因子。
　　視黃酸(Retinoic acid，RA)是胚胎發(fā)育過(guò)程中必需的微量營(yíng)養(yǎng)素，也是一種作用廣泛的信號(hào)分子，與心臟發(fā)育的多個(gè)階段有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RA缺乏會(huì)造成心血管系統(tǒng)發(fā)育異常，與DGS特征相似。
　　為此，我們考慮RA是否為tbx1基因表達(dá)與NCCs發(fā)育之間的“橋梁”？我們以斑馬魚(yú)為模式生物，研究了tbx1

3、基因表達(dá)對(duì)NCCs發(fā)育的影響，并探討RA在其中所起的作用。
　　為了模擬DGS患者tbx1基因單倍劑量不足，在第一部分，我們首先構(gòu)建了tbx1基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚(yú)模型。通過(guò)顯微注射特異性的tbx1基因反義寡核苷酸t(yī)bx1-MO，下調(diào)tbx1基因表達(dá)，導(dǎo)致斑馬魚(yú)表型異常，表現(xiàn)為心臟環(huán)化障礙、心包水腫、下頜骨減小、耳囊減小、眼睛減小。通過(guò)tbx1-MO效率驗(yàn)證，證實(shí)tbx1基因表達(dá)下調(diào)成功。
　　在tbx1基因表達(dá)下調(diào)的模型中，

4、我們研究NCCs的發(fā)育過(guò)程。選取NCCs不同發(fā)育階段的標(biāo)記基因，通過(guò)胚胎整體原位雜交的方法，發(fā)現(xiàn)NCCs的起始、剝離、遷移、分化等多個(gè)發(fā)育環(huán)節(jié)都受到了tbx1基因表達(dá)下調(diào)的影響，發(fā)育過(guò)程受到抑制，心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞(Cardiac neural crest cells，CNCCs)向心臟細(xì)胞的分化障礙。
　　在第二部分，我們構(gòu)建了RA缺乏的斑馬魚(yú)模型。通過(guò)顯微注射視黃醛脫氫酶基因(raldh2)的反義寡核苷酸，下調(diào)raldh2基因表達(dá)

5、，并通過(guò)效率驗(yàn)證，證實(shí)raldh2基因表達(dá)下調(diào)成功。Raldh2基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚(yú)，表型異常，表現(xiàn)為心臟環(huán)化障礙，心包水腫、體長(zhǎng)短。而且我們發(fā)現(xiàn)，NCCs的起始、剝離、遷移與分化過(guò)程也受到了抑制，CNCCs向心臟細(xì)胞分化障礙。
　　鑒于tbx1基因表達(dá)下調(diào)與raldh2基因表達(dá)下調(diào)，NCCs發(fā)育抑制的表現(xiàn)非常相似，在第三部分，我們研究了tbx1基因表達(dá)與RA信號(hào)分子之間的關(guān)系。
　　通過(guò)原位雜交和real-time PCR

6、的檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)，tbx1基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚(yú)中，RA合成酶基因-raldh2表達(dá)降低，而RA降解酶基因-cyp26a1，cyp26b1，cyp26c1表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明tbx1基因表達(dá)下調(diào)可以從合成和降解兩方面降低斑馬魚(yú)體內(nèi)RA的水平。
　　我們?cè)隗w外人工合成斑馬魚(yú)raldh2 mRNA，對(duì)tbx1基因表達(dá)下調(diào)的斑馬魚(yú)進(jìn)行拯救。實(shí)驗(yàn)證明，外源raldh2基因可以拯救tbx1基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)果，異常的斑馬魚(yú)表型以及NCCs標(biāo)記基因的表