視黃酸信號(hào)對(duì)斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育調(diào)控的初步研究.pdf

1、背景：人的一生目前只有兩個(gè)牙列，即乳牙列與恒牙列，在12-13歲恒牙列完全萌出之后，人類本身的牙齒就隨著使用的時(shí)間產(chǎn)生不可避免的磨耗。人類口齒的健康健全是消化系統(tǒng)發(fā)揮功能，為身體輸送營(yíng)養(yǎng)的開(kāi)端，但隨著人類壽命的延長(zhǎng)、食物的多樣化發(fā)展，各種各樣的先天性和后天性因素使得不少患者的牙齒逐漸失去原有功能。而一旦恒牙缺失，我們沒(méi)有辦法進(jìn)行完整的牙齒再生，缺牙對(duì)于患者來(lái)說(shuō)既是健康上的威脅，又是心理上的障礙。目前有學(xué)者把種植義齒形容為人類的“第三副牙

2、齒”，誠(chéng)然，與傳統(tǒng)可摘活動(dòng)義齒或固定橋修復(fù)體相比，種植義齒是目前對(duì)正常牙傷害最小的修復(fù)手段，但其不可回避的具有一系列諸如對(duì)骨量及個(gè)體身體健康要求高、費(fèi)用昂貴、修復(fù)周期長(zhǎng)等劣勢(shì)。隨著人們對(duì)于牙齒保健意識(shí)的提高，一副真正屬于個(gè)體的“第三副牙齒”成為了牙醫(yī)界亟待解決的難題和焦點(diǎn)。牙齒的發(fā)育與再生成為了極具研究?jī)r(jià)值的熱點(diǎn)科學(xué)。近年來(lái)，牙齒發(fā)育與再生的模式動(dòng)物多選擇小鼠、小香豬、狗等哺乳動(dòng)物，大量研究也帶來(lái)了我們對(duì)于牙齒的發(fā)生發(fā)育、遷移分化、組織

3、間相互作用及牙齒硬組織的沉積形成與萌出、牙根的生長(zhǎng)都有了不同程度的認(rèn)知。然而，哺乳動(dòng)物具有一定的局限性，由于哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育在母體內(nèi)進(jìn)行，局部組織深埋于皮下或結(jié)締組織下，實(shí)驗(yàn)與觀察都有一定的不便，實(shí)驗(yàn)條件較為苛刻繁瑣，使得受精后數(shù)小時(shí)內(nèi)的最早期胚胎發(fā)育過(guò)程中所牽涉到的分子調(diào)控機(jī)制的探索遇到了一些壁壘。斑馬魚(yú)是一種新型卵生的模式動(dòng)物，具備一系列研究牙齒發(fā)育的優(yōu)勢(shì)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物。視黃酸對(duì)脊椎動(dòng)物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程都起著非

4、常重要的調(diào)控作用，在牙齒的發(fā)育初萌上也起著舉足輕重的作用。本實(shí)驗(yàn)視黃酸促進(jìn)模型主要是利用外源性視黃酸對(duì)各類魚(yú)系進(jìn)行培養(yǎng)，視黃酸抑制模型利用raldh2合成酶抑制劑DEAB進(jìn)行外源性培養(yǎng)以抑制RA的合成，同時(shí)利用熱激蛋白過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄RA降解酶cyp26a1促進(jìn)視黃酸的分解，從而的到視黃酸缺乏或缺少的模型。在處理后的模型上進(jìn)行整胚原位雜交，檢測(cè)牙齒特異性蛋白的表達(dá)量。同時(shí)利用牙齒特異性熒光魚(yú)系觀察熒光表達(dá)的情況。
　　目的：構(gòu)建Hsp-

5、cyp26a1-GFP;cryaa-Venus重組質(zhì)粒，篩選RA降解酶cyp26a1編碼序列過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因魚(yú)系。探究加入外源性RA和阻斷體內(nèi)RA合成以及加速體內(nèi)RA降解對(duì)斑馬魚(yú)牙齒發(fā)育的影響。
　　方法：首先構(gòu)建Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus重組質(zhì)粒，從斑馬魚(yú)的cDNA文庫(kù)中克隆出cyp26a1的編碼序列，連接進(jìn)入熱激蛋白質(zhì)粒中。運(yùn)用顯微注射技術(shù)向單細(xì)胞期的斑馬魚(yú)胚胎動(dòng)物極內(nèi)注射重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒將隨機(jī)整合到

6、斑馬魚(yú)基因組內(nèi)，經(jīng)數(shù)代繁育篩選獲得能夠穩(wěn)定遺傳的 Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)系。同時(shí)克隆四個(gè)神經(jīng)嵴的特異性標(biāo)記物的編碼序列:dlx2a，dlx2b，scpp5，barx1。TA克隆后得到 PGEMT載體上的基因序列。測(cè)序得到片段插入方向，根據(jù)插入方向選擇sp6或t7RNA聚合酶，進(jìn)行RNA合成轉(zhuǎn)錄。利用不同濃度RA及DEAB處理轉(zhuǎn)基因魚(yú)系Tg：dlx2b-GFP和ABGo野生型斑馬魚(yú)。熱激活cyp

7、26a1后檢測(cè)體內(nèi)各牙齒特異性蛋白質(zhì)表達(dá)水平高低。
　　結(jié)果：成功克隆了cyp26a1的轉(zhuǎn)錄本序列，經(jīng)顯微注射成功篩選出熱激蛋白過(guò)表達(dá)cyp26a1的魚(yú)系Tg：Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus。同時(shí)獲得了4個(gè)基因的反義mRNA核酸探針。與未處理的二甲基亞砜對(duì)照組相較而言，經(jīng)過(guò)1×10-7?M視黃酸信號(hào)處理的barx1組、dlx2a在咽弓神經(jīng)嵴的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并有由咽弓神經(jīng)嵴向后段咽弓牙齒萌出位點(diǎn)遷移的趨勢(shì)，綠

8、色熒光向周邊咽弓擴(kuò)散；4×10-7?M RA處理組胚胎致畸率和死亡率極高，3×10-7?M RA處理組1/3胚胎發(fā)育遲緩。DEAB處理組神經(jīng)嵴發(fā)育不良，barx1、dlx2a表達(dá)降低，dlx2b在牙齒位點(diǎn)的表達(dá)有所延遲。Cyp26a1經(jīng)過(guò)熱激活后能夠成為很好的內(nèi)源性加速RA降解的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似利用DEAB阻斷RA合成的結(jié)果，barx1的表達(dá)明顯降低，dlx2a表達(dá)發(fā)生滯后效應(yīng)，dlx2b和scpp5的表達(dá)有所延遲。
　　結(jié)論：