神經(jīng)嵴源肌腱干細胞與外周神經(jīng)共同參與肌腱損傷修復(fù)的研究.pdf

1、肌腱是連接肌肉和骨的致密性結(jié)締組織。因常年受力的作用，在臨床上肌腱易發(fā)生應(yīng)力損傷。肌腱的修復(fù)過程一般依賴于細胞合成胞外基質(zhì)及損傷區(qū)域的微環(huán)境，主要包括：細胞的類型、損傷區(qū)域的新生血管、神經(jīng)分布等。當(dāng)肌腱損傷后，肌腱細胞大量合成膠原等胞外基質(zhì)成分形成新生的組織填補損傷位點。但由于成熟的肌腱細胞增殖速率緩慢，不足以完成肌腱組織的重建。因此肌腱組織一旦損傷后，具有分化成為功能性肌腱細胞的肌腱干/祖細胞會參與著組織的再生過程，但是對于肌腱干/祖

2、細胞的來源、分布及免疫表型存在著巨大的分歧。前期研究發(fā)現(xiàn)，在肌腱損傷自愈過程中存在著一類具有神經(jīng)嵴特性的干細胞參與肌腱損傷的自發(fā)修復(fù)。但是，這群細胞寄居于機體的何處，又是如何進入損傷的肌腱組織中還沒有得到滿意的答案。同時，這群細胞是否能被激活進而分化為功能性的肌腱細胞并能促進肌腱組織重建，也不得而知。研究中我們還發(fā)現(xiàn)，肌腱旁組織中包含有外周神經(jīng)，這些外周神經(jīng)組織中的細胞在發(fā)育過程中均為神經(jīng)嵴分化而來。在受損傷肌腱中神經(jīng)嵴源肌腱干細胞（N

3、CO-TDSCs）是否來源于這些外周神經(jīng)組織值得探索。
　　針對以上問題，本文制定了相關(guān)的研究內(nèi)容并得到以下結(jié)果與結(jié)論：
　　①富含血小板血漿（PRP）激活神經(jīng)嵴源肌腱干細胞參與跟腱斷裂再生
　　采用酶消化法分離提取得到的神經(jīng)嵴源肌腱干細胞，具有克隆團形成、多向分化能力。同時，這種干細胞表達許多干細胞特征標(biāo)注物：nucleostemin(NS),Oct-4,SSEA-4,α-SMA,CD29,CD44,CD90,Sox

4、10,Snail,以及P75。將PRP用Ca2+激活后的PRGF體外處理NCO-TDSCs，能增強細胞的生存活力，加快DNA合成，促進細胞的增殖。采用穿膜小室模型考察PRP對NCO-TDSCs遷移能力的影響。結(jié)果證實，PRGF具有顯著的促進細胞遷移，招募干細胞的作用。受PRGF體外處理后，NCO-TDSCs的Collagen I、Collagen III、及α-SMA表達水平顯著性上調(diào)，干細胞趨向分化為功能性肌腱細胞。體外培養(yǎng)的膠原支架

5、結(jié)構(gòu)中NCO-TDSCs具有良好的細胞活性與長梭形細胞形態(tài)，PRP能促進細胞的縱向排列，可以加快腱系纖維狀結(jié)構(gòu)的形成。此外，膠原水凝膠微環(huán)境能通過上調(diào)NCO-TDSCs的Collagen I、Collagen III、Scleraxis、Tenascin-C的基因表達，促進干細胞向肌腱系分化，同時，PRP能更加顯著的促進這一過程，加快NCO-TDSCs腱系功能的激活。進一步的體內(nèi)研究結(jié)果顯示，膠原/NCO-TDSCs水凝膠移植物(CTC

6、）及PRP/膠原/NCO-TDSCs水凝膠移植物（PCTC）能增強斷裂肌腱組織恢復(fù)組織結(jié)構(gòu)，進而保持較強的力學(xué)性能，其中含有PRP的植入物效果更優(yōu)。
　　②神經(jīng)嵴來源的外周神經(jīng)組織輔助肌腱損傷后血管新生
　　實驗采用 Sox10-Cre/ROSA26-Flox-RFP轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象示蹤外周神經(jīng)細胞。在設(shè)計的髕腱窗口損傷及跟腱斷裂模型中，均發(fā)現(xiàn)了紅色熒光蛋白（RFP）標(biāo)記的神經(jīng)細胞包繞新生血管組織的特性。對于髕腱損傷模型

7、，損傷1周后即發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)系統(tǒng)細胞內(nèi)遷進入損傷的肌腱組織中，并在損傷的部位參與著非成熟新生血管的形成。對于更大傷口的跟腱斷裂模型，對損傷區(qū)域進行免疫熒光染色鑒定，發(fā)現(xiàn)外周神經(jīng)迅速出芽內(nèi)遷進入損傷部位，其中，部分神經(jīng)組織分泌神經(jīng)多肽（Neuropeptide Y1），而關(guān)聯(lián)的新生血管組織中則表達神經(jīng)多肽受體（Neuropeptide Y1 receptor），結(jié)果表明在損傷肌腱中，神經(jīng)-血管兩者呈現(xiàn)顯著的關(guān)聯(lián)性。
　?、凵窠?jīng)嵴源細胞

8、遷出神經(jīng)組織參與肌腱損傷修復(fù)
　　采用Sox10-Cre/ROSA26-Flox-RFP轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象示蹤可能存在的神經(jīng)嵴來源細胞參與跟腱斷裂修復(fù)。跟腱斷裂損傷后，許多RFP陽性細胞由外周神經(jīng)組織遷移出來進入肌腱損傷部位，這些RFP陽性的細胞在體內(nèi)分別表達神經(jīng)元標(biāo)志物Tuj1、施旺細胞標(biāo)志物S100β。同時，這些細胞中還含有表達NCO-TDSCs標(biāo)志物P75和Sox10的細胞；以及表達FAP和Vimentin的成纖維細胞。此

9、結(jié)果在體內(nèi)水平證實由神經(jīng)組織遷出進入肌腱損傷部位的細胞為混合的細胞群體。分離損傷2周后跟腱中的細胞，其中 RFP(+)細胞約占到總細胞數(shù)的27％。對分離得到的RFP(+)細胞進行體外免疫熒光染色鑒定，其中含有表達Tuj1、S100β、P75、FSP1、FAP、Sox10陽性的細胞。同時部分RFP(+)細胞具有干細胞的分化潛能特性。此結(jié)果在體外水平證實RFP(+)細胞為混合的細胞群體，這群細胞中含有：神經(jīng)元、施旺細胞、NCO-TDSCs、