人剪切修復基因XPD對肝癌細胞生長抑制的研究.pdf

1、目的研究表明，人剪切修復基因著色性干皮病基因D(Xeroderma Pigmentosum D，XPD)作為重要的DNA修復路徑----核苷酸切除修復中的關鍵因子，在DNA修復路徑中起著重要的作用。XPD基因發(fā)生突變時，腫瘤易感性更高。本實驗研究野生型XPD基因對肝癌細胞生長的影響，探討XPD基因抑制肝癌細胞生長的機制。 方法: 用堿裂解法提取空載質粒pEGFP-N2和重組質粒pEGFP-N2-XPD，提取出的質粒以KPNⅠ、B

2、GIⅡ和SPHⅠ酶切鑒定。實驗分三組，重組質粒XPD-N2、空載質粒N2，并用與XPD-N2、N2具有相同遺傳背景和代數的SMMC-7721細胞作為空白對照。用脂質體轉染法瞬時轉染三組細胞。熒光顯微鏡下觀察轉染后綠色熒光蛋白報告基因表達情況。提取各組細胞總RNA，合成cDNA，用聚合酶鏈反應(PCR)檢測三組細胞中XPD、c-myc、cda25A、cdK2表達情況。使用蛋白抽提液分別提取三組細胞的總蛋白，使用全自動生化分析儀測定蛋白濃度

3、，Western blot法檢測細胞中XPD、c-myc、cdc25A、cdK2表達量變化。流式細胞儀器檢測細胞周期，分析細胞各周期的百分率。在96孔板中進行三組細胞的轉染，MTT法觀察細胞增殖的活力。 結果: 1、提取出的重組質粒pEGFP-N2-XPD用酶切鑒定，與Genebank中公布的人類XPD完整mRNA序列NM_000400相吻合。 2、轉染質粒后40h，在熒光顯微鏡下，可以在SMMC-7721-pE

4、GFP-N2，SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD中觀察到綠色熒光蛋白的表達。 3、RT-PCR、Western blot檢測發(fā)現SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD細胞與SMMC-7721-pEGFP-N2和SMMC-7721兩對照組相比，其XPD表達明顯增高；c-myc、cdc25A、cdK2相對表達量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義。 4、流式細胞儀結果顯示：與其它二組相比，轉染了pEGFP-N2-XPD