人肝癌干細(xì)胞單抗抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移.pdf

1、肝癌是世界5大高發(fā)癌癥之一，在中國，肝癌是死亡率前三的惡性腫瘤，而轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肝癌預(yù)后差的主要原因，晚期肝癌放化療后復(fù)發(fā)率達(dá)到60％。研究認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞同腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，因此靶向肝癌干細(xì)胞治療可能為肝癌的治療提供新的思路。
　　 采用酶消化法分離肝癌組織中癌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，同時將肝癌組織在SCID鼠體內(nèi)進(jìn)行移植瘤傳代，以流式細(xì)胞術(shù)檢測其中肝癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物。通過PKH26染色實驗，無血清懸浮培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫

2、熒光確定肝癌干細(xì)胞研究的細(xì)胞系模型。在以免疫熒光流式細(xì)胞術(shù)和抑制細(xì)胞增殖實驗篩選抗肝癌干細(xì)胞的功能性單抗之后，采用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法檢測單抗的表達(dá)情況；采用抑制細(xì)胞增殖實驗，Transwell實驗進(jìn)行單抗體外功能的研究；采用裸鼠移植瘤治療實驗進(jìn)行單抗體內(nèi)功能的研究。以Westernblot鑒定單抗識別抗原蛋白分子量，通過免疫親和層析和MALDI-TOP-PMF質(zhì)譜技術(shù)鑒定肝癌干細(xì)胞相關(guān)的功能基因。免疫共沉淀和細(xì)胞免疫熒光共定位對

3、質(zhì)譜鑒定結(jié)果進(jìn)行回證分析。
　　 成功從肝癌組織中分離癌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同肝癌組織中肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物ESA、CD133，CD24、CD44、AFP的表達(dá)差異顯著。人肝癌細(xì)胞株MHCC97H在無血清培養(yǎng)條件下可成球生長，PKH26染色結(jié)果顯示MHCC97H球體多由單個肝癌干細(xì)胞增殖分化形成，球體細(xì)胞較親本細(xì)胞順鉑耐藥性增強(qiáng)(IC50:69.7ug/mlvs22.lug/ml)，CD90+細(xì)胞比例顯著上調(diào)(

4、23.8%vs2.7%)，且觀察到細(xì)胞球中CD90與PKH26共表達(dá)，證明CD90+MHCC97H細(xì)胞可能是肝癌干細(xì)胞。雜交瘤單抗3G7、4F11、11C9、1587、15D2均能較特異地識別MHCC97H中CD90+腫瘤干細(xì)胞，其中11C9和4F11在CD90+肝癌干細(xì)胞識別比例分別是42.3%和21.6%。單抗11C9顯著球體細(xì)胞增殖抑制（抑制率23.2%），而對MHCC97H細(xì)胞無明顯增殖抑制作用。MHCC97H成球細(xì)胞中單抗11

5、C9陽性細(xì)胞的比例較親本細(xì)胞顯著上調(diào)(11.9%vs3.8%)，細(xì)胞球免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)11C9與PKH26共染色，并且11C9與CD90共表達(dá)，證明單抗11C9識別CD90+肝癌干細(xì)胞。11C9+細(xì)胞同親本細(xì)胞和11C9-細(xì)胞相比，耐藥性更強(qiáng)(5-FU，IC50:289.37ug/mlvs101.25ug/mlvs71.26ug/ml)；成球能力更強(qiáng)（成球數(shù)：（6+3）VS（5±3）vs（3±3））；侵襲能力更強(qiáng)（侵襲細(xì)胞數(shù)：（111±

6、14）vs（87±14）vs（57±4））；遷移能力更強(qiáng)(遷移細(xì)胞數(shù)：(156±15)vs（130±16）vs（114±11））。在體內(nèi)，單抗11C9聯(lián)合5-FU治療可以非常顯著地能顯著地抑制肝癌移植瘤的復(fù)發(fā)。MALDI-TOP-PMF質(zhì)譜技術(shù)鑒定單抗11C9識別靶抗原是A（見注釋），免疫共沉淀和細(xì)胞免疫熒光共定位回證的結(jié)果也證實單抗11C9識別的靶抗原確為A。同樣，單抗4F11的陽性細(xì)胞比例在MHCC97H成球細(xì)胞中較親本細(xì)胞顯著上調(diào)

7、(12.5%vs2.7%)，單抗4F11可在細(xì)胞球中與PKH26共染色，并與CD90共表達(dá)，證明單抗4F11識別CD90+肝癌干細(xì)胞。單抗4F11對成球細(xì)胞增殖的抑制率遠(yuǎn)大于對親本MHCC97H細(xì)胞增殖的抑制率(29.4%vs12.0%)，并且并且強(qiáng)烈抑制MHCC97H細(xì)胞的自我更新（成球抑制率達(dá)到58.O%）。4F11還可顯著抑制MHCC97H細(xì)胞的體外侵襲和遷移，抑制率分別為48.6%和47.6%。MALDI-TOP-PMF質(zhì)譜技術(shù)

8、鑒定單抗4F11識別靶抗原可能是B，C和D（見注釋）。
　　 肝癌組織存在腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞株MHCC97H中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的主要是CD90，單抗11C9和4F11均能較特異地識別CD90+肝癌干細(xì)胞。單抗11C9能顯著抑制富肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞的增殖，11C9+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的多種特征，單抗11C9聯(lián)合化療能顯著抑制人肝癌移植瘤的復(fù)發(fā)，提示單抗11C9是一個有潛力的靶向肝癌干細(xì)胞的靶向治療劑，部分肝癌的耐藥性可能同11C9+肝