人剪切修復(fù)基因XPD對(duì)肝癌細(xì)胞中p53和Ets-1基因的作用.pdf

1、目的:
　　將野生型XPD基因通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞HepG2中,再加入p53抑制劑Pifithrin-α(PFT-α),觀察基因XPD、p53、Ets-1的表達(dá)變化和對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。
　　方法:
　　1、復(fù)蘇購(gòu)買于美國(guó)模式菌種收集中心的人肝癌細(xì)胞HepG2,采用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培育、傳代、凍存菌種;2、將含有pEGFP-N2空載質(zhì)粒(N2質(zhì)粒)(從美國(guó)Clontech公司購(gòu)買)和pE

2、GFP-N2-XPD重組質(zhì)粒(XPD質(zhì)粒)(由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)的JM-109大腸桿菌的菌液,分別進(jìn)行搖菌擴(kuò)增;3、使用質(zhì)粒提取試劑從菌液中分別提取N2質(zhì)粒、XPD質(zhì)粒;4、設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組,1組:空白對(duì)照組、2組:脂質(zhì)體對(duì)照組、3組:pEGFP-N2組、4組:pEGFP-N2-XPD組、5組:pEGFP-N2-XPD+Pifithrin-α組、6組:Pifithrin-α組。5、使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù),將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,以空白組做對(duì)照,利用熒光

3、顯微鏡,察看細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá),24h后加入p53抑制劑Pifithrin-α(PFT-α),在孵育24h后收集細(xì)胞;6、提取HepG2細(xì)胞總RNA,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中XPD、p53、Ets-1的mRNA表達(dá)變化;7、提取細(xì)胞總蛋白,用蛋白印記法(Western blot)檢測(cè)XPD、p53、phospho-p53(ser-15)、Ets-1蛋白表達(dá)的變化。8、使用四甲基偶氮唑鹽

4、比色法(MTT)觀察HepG2細(xì)胞增殖的活力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果:
　　1、轉(zhuǎn)染N2空載質(zhì)粒和XPD重組質(zhì)粒后,在綠色熒光顯微鏡下,細(xì)胞表達(dá)出大量綠色熒光。2、利用RT-PCR方法檢測(cè)mRNA表達(dá),轉(zhuǎn)染XPD重組質(zhì)粒后,與空白對(duì)照組相比,XPD、p53的mRNA表達(dá)水平上升(P<0.01),Ets-1表達(dá)下降(P<0.01);在加入Pifithrin-α(PFT-α)后,與pEGFP-N2-XP

5、D重組質(zhì)粒組比較,Ets-1表達(dá)出現(xiàn)部分上升(P<0.01),XPD、p53沒有明顯變化。3、使用Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染XPD重組質(zhì)粒后,與空白對(duì)照組相比, XPD、p53、p-p53蛋白表達(dá)水平增加(P<0.01),Ets-1蛋白水平下調(diào)(P<0.01);加入Pifithrin-α后,與pEGFP-N2-XPD組比較,p-p53蛋白表達(dá)明顯下降,Ets-1出現(xiàn)上升(P<0.01),而XPD、p53沒有明顯變化。4、

6、MTT法觀察細(xì)胞,將XPD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞后,增殖能力下降,加入Pifithrin-α(PFT-α)后出現(xiàn)部分上升(P<0.01)。5、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示,轉(zhuǎn)染XPD質(zhì)粒后,HepG2細(xì)胞進(jìn)入S期發(fā)生阻滯,停滯在G1期,加入PFT-α后阻滯作用減弱。
　　結(jié)論:
　　將野生型XPD基因轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中,促使p53表達(dá)上調(diào),同時(shí)抑制了原癌基因Ets-1的表達(dá);加入p53抑制劑后,這種作用被部分逆轉(zhuǎn)了,可以認(rèn)為XPD