重組人隱花色素蛋白I的表達(dá)純化及其在制備放療保護(hù)劑中的應(yīng)用.pdf

1、在癌癥的臨床治療方法中，放療的適應(yīng)癥最為廣泛，70％以上的惡性腫瘤患者在其治療的某個(gè)階段都需要接受放療。放射治療的目的是最大限度地將放射劑量集中到病變區(qū)，而周?chē)＝M織或器官則需要盡量少受不必要的照射。因此，尋找一些盡可能地保護(hù)正常皮膚、組織、器官的方法就成為了放療過(guò)程中減輕患者痛苦、提高治療效果的關(guān)鍵所在。
　　在本研究中，我們通過(guò)原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，利用E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)并成功表達(dá)出人隱花色素蛋白Ⅰ(hCRY

2、1)。我們?cè)诙啻螌?shí)驗(yàn)探索的過(guò)程中篩選獲得了能夠高效表達(dá)hCRY1的菌株。我們對(duì)溫度、轉(zhuǎn)速、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等多項(xiàng)影響重組蛋白表達(dá)的因素進(jìn)行了摸索，最終總結(jié)出最適宜hCRY1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)條件。我們?cè)谘芯恐胁捎冒w溶解、梯度透析復(fù)性、鎳柱親和純化以及超濾置換的蛋白純化工藝，1L菌液可收獲10-15 mg純度超過(guò)95％的hCRY1，該產(chǎn)率遠(yuǎn)高于目前所已知的其他方法，而由于該原核表達(dá)純化方法所需要的培養(yǎng)基及后續(xù)純化原料相對(duì)廉價(jià)，成

3、本經(jīng)計(jì)算遠(yuǎn)低于真核表達(dá)純化方法和化學(xué)合成多肽方法。
　　此外，我們還分別在Hela細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)中所產(chǎn)生的H2A.X foci熒光強(qiáng)度的定量檢測(cè)，驗(yàn)證了純化所得的hCRY1具有射線(xiàn)損傷防護(hù)功能;在HaCaT細(xì)胞中驗(yàn)證了hCRY1射線(xiàn)損傷防護(hù)效果與其濃度的相關(guān)性。為了排除了hCRY1的毒副作用對(duì)H2A.X foci熒光強(qiáng)度的影響，我們以TNF-α為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)經(jīng)過(guò)hCRY1以及對(duì)照蛋白處理后的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行了檢測(cè)，