重組人隱花色素蛋白I的表達純化及其在制備放療保護劑中的應(yīng)用.pdf

1、在癌癥的臨床治療方法中，放療的適應(yīng)癥最為廣泛，70％以上的惡性腫瘤患者在其治療的某個階段都需要接受放療。放射治療的目的是最大限度地將放射劑量集中到病變區(qū)，而周圍正常組織或器官則需要盡量少受不必要的照射。因此，尋找一些盡可能地保護正常皮膚、組織、器官的方法就成為了放療過程中減輕患者痛苦、提高治療效果的關(guān)鍵所在。
　　在本研究中，我們通過原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建，利用E.coli BL21(DE3)誘導(dǎo)并成功表達出人隱花色素蛋白Ⅰ(hCRY

2、1)。我們在多次實驗探索的過程中篩選獲得了能夠高效表達hCRY1的菌株。我們對溫度、轉(zhuǎn)速、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間等多項影響重組蛋白表達的因素進行了摸索，最終總結(jié)出最適宜hCRY1蛋白誘導(dǎo)表達的實驗條件。我們在研究中采用包涵體溶解、梯度透析復(fù)性、鎳柱親和純化以及超濾置換的蛋白純化工藝，1L菌液可收獲10-15 mg純度超過95％的hCRY1，該產(chǎn)率遠高于目前所已知的其他方法，而由于該原核表達純化方法所需要的培養(yǎng)基及后續(xù)純化原料相對廉價，成

3、本經(jīng)計算遠低于真核表達純化方法和化學(xué)合成多肽方法。
　　此外，我們還分別在Hela細胞中，通過細胞DNA損傷修復(fù)中所產(chǎn)生的H2A.X foci熒光強度的定量檢測，驗證了純化所得的hCRY1具有射線損傷防護功能;在HaCaT細胞中驗證了hCRY1射線損傷防護效果與其濃度的相關(guān)性。為了排除了hCRY1的毒副作用對H2A.X foci熒光強度的影響，我們以TNF-α為陽性對照，對經(jīng)過hCRY1以及對照蛋白處理后的細胞凋亡情況進行了檢測，