豬傳染性胸膜肺炎血清7型菌株的分離鑒定與體內(nèi)誘導表達基因的篩選.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起豬的一種高度接觸性傳染病，該病嚴重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。本研究就其分離鑒定與血清7型菌株體內(nèi)誘導基因篩選作了以下工作:
　　1.APP的分離鑒定
　　本研究從四川某豬場的疑似豬傳染性胸膜肺炎的病豬中分離到一

2、株革蘭氏陰性短桿菌。經(jīng)染色鏡檢、生化試驗、PCR檢測、血清型檢測和藥敏試驗等鑒定，結果表明分離株的生化試驗結果與多數(shù)APP分離株的一致，采用PCR可擴增出約450bp左右的APP特異性目的條帶，利用瓊脂擴散試驗對分離株進行血清型鑒定為7型，藥敏試驗結果顯示該分離株對大多數(shù)藥物都比較敏感，僅對林可，霉素耐藥。綜合判定該分離株為豬APP的7型菌株。
　　2.APP7基因組表達文庫的構建
　　本研究用pET28a/b/c載體構建表

3、達文庫。提取APP血清7型的基因組DNA，經(jīng)Sau3AⅠ經(jīng)行不完全酶切，回收0.5～2 kb的DNA片段。純化后的DNA片段與經(jīng)具有相同酶切位點的BamHⅠ單酶切及CIAP去磷酸化處理的pET28a/b/c質(zhì)粒連接，將連接產(chǎn)物電轉化至DH5α感受態(tài)細胞，利用含有卡那抗性的LB平板篩選陽性重組質(zhì)粒。隨機挑選部分陽性克隆進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，結果顯示插入片段在0.5～2kb的范圍內(nèi)，重組陽性率大于85％，共收集陽性克隆約26000個，

4、大于理論計算值，符合文庫要求，表明文庫構建成功。
　　3.基因組表達文庫的篩選
　　采用原位免疫印跡技術對表達文庫進行篩選:表達文庫轉化菌液稀釋后均勻涂布于含有kan抗性的LB平板，每個平板含300～500個菌落，37℃培養(yǎng)10h后將菌落影印至滅菌硝酸纖維素膜(NC膜)上。帶菌NC膜轉移至含kana和IPTG的LB平板37℃誘導培養(yǎng)4h后，用氯仿蒸汽作用15 min以裂解細菌釋放蛋白。NC膜用10％脫脂奶粉封閉過夜，并依次與