豬傳染性胸膜肺炎鑒別診斷方法和胸膜肺炎放線桿菌外毒素單克隆抗體研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種高度接觸傳染的呼吸道疾病。該病給集約化養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，目前已分離鑒定了15種血清型的APP，其毒力因子非常復(fù)雜，型間交叉免疫保護(hù)率低，因而該病的診斷與防制相當(dāng)困難。APP的Apx外毒素是其主要的毒力因子。已證實了ApxⅠ、ApxⅡ與ApxⅢ的溶血活性及對巨噬細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞的毒性作

2、用，且ApxⅢ被證實有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性，而ApxⅣ僅具有微弱的溶血活性，其它作用尚不清楚。敏感、特異的診斷方法將有利于豬傳染性胸膜肺炎的控制。目前我國普遍應(yīng)用的診斷方法為間接血凝試驗(IHA)，該方法具有血清型特異性，不適合于對APP的普查。最近發(fā)現(xiàn)的ApxⅣ存在于所有血清型APP中，且具有種特異性，適合用于建立可以普查APP的診斷方法。ApxⅣ的另一特點為體內(nèi)誘導(dǎo)的毒素，而目前市面上用體外培養(yǎng)方法制備的疫苗中均不存在ApxⅣ，因此基

3、于ApxⅣ的診斷方法可以鑒別診斷自然感染豬與疫苗免疫豬。為了建立有效的診斷方法及對APP外毒素作用機(jī)制進(jìn)行深入研究提供特異性單克隆抗體，我們開展了以下工作： 1apxⅣ基因的克隆與及其在大腸桿菌中的表達(dá)依據(jù)APP血清1型的apxⅣ基因序列(GeneBank登陸號：AF021919)合成特異性引物，分三段從APP0306SYML中分別擴(kuò)增了apxⅣ基因的5'-端3.6Kb、5'-端2.5Kb和3'-端3.0Kb片斷，分別克隆到pM

4、D-18T，獲得重組質(zhì)粒pTapxⅣ3.6、pTapxⅣA5與pTapxⅣA3，并進(jìn)行了測序；將apxⅣA5與apxⅣA3分別克隆到質(zhì)粒pET-28b的T7啟動子下游，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pETapxⅣA5與pETapxⅣA3，分別用于表達(dá)ApxⅣN-端與C-端蛋白，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高效表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，表達(dá)的重組蛋白的分子量分別為90kDa與115kDa，分別命名為rApxⅣAN與r

5、ApxⅣAC，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，Westernblot證實表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。 2鑒別診斷方法的建立用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白rApxⅣAN建立了ApxⅣ-ELISA方法。用方陣滴定確定了抗原最佳包被濃度為2.9μg/mL，血清最佳稀釋倍數(shù)為1：80。通過檢測53份豬傳染性胸膜肺炎陰性血清，確定該方法的臨界值為0.336。該方法的重復(fù)性良好。用該方法從副豬嗜血桿菌(HPS)、產(chǎn)毒素巴氏桿菌(DNT+Pm)、大腸

6、桿菌(E.coli)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬衣原體(CP)的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及APP全菌滅活苗與類毒素菌苗免疫豬血清中檢測不到ApxⅣ抗體，而從APP活菌感染的動物血清中能檢測到ApxⅣ抗體，說明該方法不僅具有種特異性，只能用于APP感染的檢測，還可以鑒別診斷全菌滅活疫苗或亞單位疫苗免疫豬與自然感染豬，而且該方法能檢測所有血清型APP，可用于APP的血清學(xué)普查。 3外毒

7、素單克隆抗體的制備用大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣAN與rApxⅣAC作為免疫原，分別建立了2、4、2、4及4株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，16株雜交瘤細(xì)胞分別命名為4與16(anti-rApxⅠ)，14、39、3F11與16G10(anti-rApxⅡ)，44與53(anti-rApxⅢ)，1A8、1G5、3F7與4H9(anti-rApxⅣAN)，1B12、2F5、4D8與4G2(anti

8、-rApxⅣAC)。染色體計數(shù)結(jié)果證明所有雜交瘤細(xì)胞確實為脾細(xì)胞與SP2/O細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。Westernblot與ELISA說明所有單克隆抗體的特異性良好，且rApxⅠ、rApxⅡ及rApxⅢ的單克隆抗體具有良好的與相應(yīng)天然毒素反應(yīng)的結(jié)合活性，由于體外培養(yǎng)時不能獲得ApxⅣ，因而ApxⅣ的單克隆抗體與天然ApxⅣ的結(jié)合活性有待于進(jìn)一步鑒定。用小鼠腹水生產(chǎn)的上述16株單克隆抗體的ELISA效價分別為100×29與100×28，100×2

9、13、100×29、100×29與100×27，100×214與100×211，100×29、100×210、100×29、100×28、100×210、100×211、100×29和100×28。單克隆抗體16、14、44、1A8與1B12屬于IgG1亞類，其它均屬于IgG2a亞類。 4單克隆抗體識別表位分析用相加ELISA分析了所得單克隆抗體識別表位，結(jié)果表明4與16可能識別同一抗原表位，14、39、3F11與16G10可能