農(nóng)桿菌介導(dǎo)核盤菌菌絲轉(zhuǎn)化體系的建立及SsDRV下調(diào)基因Ss-CYP1的功能的初步研究.pdf

1、核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一種世界性分布的植物病原真菌,可以在植物的多個(gè)生育期產(chǎn)生危害,引起莖腐病、猝倒病、頸腐病、花期枯萎病和菌核病等。其寄主廣泛,菌核存活能力強(qiáng),難以防治,目前主要通過(guò)化學(xué)藥劑控制該病害。
　　 2006年,核盤菌的全基因組序列公布,為該菌的致病機(jī)理研究提供了有利條件?？墒悄壳瓣P(guān)于核盤菌的分子生物學(xué)研究較少,主要是受其轉(zhuǎn)化方法的限制。至今已有PEG介

2、導(dǎo)原生質(zhì)體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)子囊孢子對(duì)核盤菌實(shí)行遺傳轉(zhuǎn)化,然而這些方法轉(zhuǎn)化周期長(zhǎng)、操作繁瑣。針對(duì)這些問(wèn)題,本課題研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)核盤菌菌絲的轉(zhuǎn)化體系并以此為基礎(chǔ)對(duì)核盤菌毒力衰退相關(guān)病毒(SsDRV)下調(diào)基因Ss-CYP1的功能進(jìn)行了初步探索,結(jié)果如下:
　　 以植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300為基礎(chǔ),在SacⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)連入潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(PtrpC-HPH-TtrpC),構(gòu)建得到T-DNA隨機(jī)插入載體pTFSS,并將載體

3、pTFSS導(dǎo)入到農(nóng)桿菌菌株EHA105中。在AS存在的條件下,把農(nóng)桿菌與核盤菌的菌絲碎片在20-22℃共培養(yǎng)。3天后,用30μg/ml潮霉素和500μg/ml的頭孢霉素對(duì)共培養(yǎng)物進(jìn)行選擇性培養(yǎng),結(jié)果成功得到了待定轉(zhuǎn)化子。用HPH特異引物對(duì)待定轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定,在所有待定轉(zhuǎn)化子的基因組DNA中均擴(kuò)增出期望片段,而在潮霉素選擇性PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的菌株中則不能擴(kuò)增出期望的片段。隨機(jī)挑選擴(kuò)增片段測(cè)序,結(jié)果表明擴(kuò)增片段均為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移

4、酶基因。表型上抗潮霉素的待定轉(zhuǎn)化子其基因組DNA與來(lái)自HPH的探針進(jìn)行點(diǎn)雜交具明顯雜交信號(hào),而非轉(zhuǎn)化子則沒(méi)有雜交信號(hào)。這些結(jié)果表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)可以成功轉(zhuǎn)化核盤菌的菌絲。
　　 轉(zhuǎn)化子在PDA上連續(xù)培養(yǎng)90 d后,仍能在抗性平板上正常生長(zhǎng)；并且通過(guò)t-檢驗(yàn)分析,連續(xù)培養(yǎng)60 d后的菌株在生長(zhǎng)速度上與出發(fā)菌株沒(méi)有顯著性差異。轉(zhuǎn)化子的菌核在PDA上經(jīng)6次連續(xù)的“萌發(fā)-菌核-萌發(fā)”培養(yǎng)后形成的菌絲也能在抗性平板上穩(wěn)定生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明由菌

5、絲得到的轉(zhuǎn)化子在無(wú)性生長(zhǎng)階段的遺傳上是穩(wěn)定的。轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性研究表明,轉(zhuǎn)化子在潮霉素濃度為150μg/ml的抗性平板上能正常生長(zhǎng)；一部分轉(zhuǎn)化子在生長(zhǎng)速度、致病力、形態(tài)特征和產(chǎn)菌核等方面與野生型菌株出現(xiàn)了差異。
　　 本研究還以菌絲塊和菌核為受體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,發(fā)現(xiàn)以菌絲塊為受體也能轉(zhuǎn)化成功。以經(jīng)過(guò)哈茨木霉裂解酶酶解后的菌絲為受體,可以克服核盤菌菌絲轉(zhuǎn)化的不穩(wěn)定性。對(duì)影響該體系轉(zhuǎn)化效果的因素分析發(fā)現(xiàn),在共培養(yǎng)之前農(nóng)桿菌用1.2 M

6、山梨醇懸浮和菌絲搗碎后用1.2 M山梨醇恢復(fù)培養(yǎng)都能提高轉(zhuǎn)化效率。同時(shí),菌絲搗碎時(shí)間30 sec和菌絲恢復(fù)培養(yǎng)2 h可以使轉(zhuǎn)化得到較好的效果。
　　 對(duì)Ss-CTP1基因的生物信息學(xué)分析表明,該基因的DNA序列含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,編碼含有208個(gè)氨基酸的蛋白。經(jīng)Xblastx分析發(fā)現(xiàn)核盤菌的全基因組中有10個(gè)基因片段與Ss-CYP1有同源性；進(jìn)一步預(yù)測(cè)表明,這其中有8個(gè)基因?qū)儆贑yclophilin基因家族。
　　

7、 實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)Ss-CYP1基因在核盤菌弱毒菌株Ep-1PN中的表達(dá)受抑制。為了研究該基因在核盤菌生長(zhǎng)、發(fā)育和致病等過(guò)程中的作用,以植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300為基礎(chǔ),分別構(gòu)建了Ss-CYP1基因沉默載體pSILENCE、Ss-CYP1基因超量表達(dá)載體pCYO和Ss-CYP1基因反向表達(dá)載體pCYS。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化核盤菌菌絲的方法,成功地得到了12個(gè)Ss-CYP1基因沉默轉(zhuǎn)化子、9個(gè)Ss-CYP1基因超量表達(dá)轉(zhuǎn)化子和1