農(nóng)桿菌介導(dǎo)小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)抗蟲基因小麥分析.pdf

1、小麥?zhǔn)侵匾募Z食作物，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良，增強(qiáng)小麥抗病蟲和耐逆境能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)，是小麥遺傳育種的一個(gè)新的方向。本研究以27份優(yōu)良普通小麥(TriticumaestivumL.)主栽品種或高代育種品系，以及4份二倍體和四倍體小麥為試材，進(jìn)行成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生的培養(yǎng)，比較其誘導(dǎo)及分化再生能力，研究影響愈傷組織形成及分化再生的因素(基因型、誘愈方式、2,4-D、ABA及KT濃度等)，篩選小麥成熟胚愈傷組織

2、誘導(dǎo)及分化再生能力強(qiáng)的基因型，建立小麥成熟胚植株再生體系。對(duì)篩選出來的適合小麥成熟胚組織培養(yǎng)的基因型，利用建立的成熟胚植株再生體系，采用農(nóng)桿菌(GV3101/pBI121：：gus)介導(dǎo)對(duì)小麥成熟胚及愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，并對(duì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素(轉(zhuǎn)化受體的基因型、負(fù)壓處理、侵染菌液的濃度、外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染時(shí)間等)進(jìn)行研究，確定選擇劑的選擇壓力。同時(shí)，對(duì)以本實(shí)驗(yàn)室選育的小麥優(yōu)良品系山農(nóng)995604的胚性愈傷組織為材料，采用農(nóng)桿菌

3、介導(dǎo)將抗蟲基因豇豆胰蛋白酶抑制劑基因CpTI轉(zhuǎn)入小麥培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)篩選獲得的抗卡那霉素再生植株，進(jìn)行PCR和實(shí)時(shí)PCR以及PCR-Southern和Southernblot檢測(cè)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)化植株后代的CpTI基因遺傳分析和抗蟲鑒定。獲得以下主要結(jié)果： 1.小麥的基因型、成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)方式、誘愈時(shí)的溫度、光照、誘愈培養(yǎng)基2,4-D和ABA濃度及分化培養(yǎng)基KT濃度等，是影響小麥成熟胚愈傷組織形成和分化再生的重要因素。應(yīng)用剝胚法(em

4、bryo-isolatedmethod，EI)和整粒法(endosperm-supportedmethod，ES)誘導(dǎo)成熟胚愈傷組織，并分別進(jìn)行分化再生培養(yǎng)，在31份小麥品種(系)中篩選出了愈傷組織誘導(dǎo)率高、質(zhì)量好、分化再生能力強(qiáng)、成苗率高的12個(gè)基因型，確定了每一基因型的最佳誘愈和分化再生途徑，30～35d即可獲得大量再生植株。適合于剝胚誘愈的有TS021(分化培養(yǎng)基為MSF5)、HB188(MSF5)、SN2618(MSF5)、HB

5、215(MSF5)、Yumai54(MSF5)、T9817(MSF5)、T.dicoccum(MSF5)和SN03J102(MSF9)；適合于整粒法的有4072(MSF1)、TS021(MSF3)、Yannong19(MSF3)、HB341(MSF3)、Jinghua1(MSF5)。在此基礎(chǔ)上建立了較為優(yōu)化和快捷的小麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)及分化再生體系，為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的成功奠定了基礎(chǔ)。 2.接種茵液濃度及侵染時(shí)間、外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

6、、負(fù)壓處理、轉(zhuǎn)化受體的基因型等因素，對(duì)小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化有較大影響。不同基因型的轉(zhuǎn)化受體，對(duì)相同農(nóng)桿菌菌株有不同的敏感性；在進(jìn)行接種侵染時(shí)，同時(shí)實(shí)施適當(dāng)?shù)呢?fù)壓處理有助于提高轉(zhuǎn)化效率；以整粒切割的成熟胚為受體的轉(zhuǎn)化，效率明顯高于以成熟胚愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化；確定了最佳接種菌液濃度及侵染時(shí)間和選擇劑的選擇壓力；在短時(shí)間(30～35d)內(nèi)即可獲得轉(zhuǎn)化苗，最高轉(zhuǎn)化率可達(dá)12.5％。以上研究結(jié)果，證明了以成熟胚為外植體源進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的可行

7、性和有效性，并初步建立了較為優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。 3.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的3株獨(dú)立的抗卡那霉素再生植株經(jīng)過分子檢測(cè)，為轉(zhuǎn)CpTI基因小麥植株，CpTI基因以單拷貝形式插入到這些轉(zhuǎn)化小麥基因組的不同位點(diǎn)。3株轉(zhuǎn)基因小麥正?？捎?，形成轉(zhuǎn)基因株系。CpTI基因在轉(zhuǎn)基因小麥T1代中的分離呈多樣性，在轉(zhuǎn)基因株系T-Ⅰ、T-Ⅲ中CpTI基因按照孟德爾3：1分離比進(jìn)行遺傳；而在轉(zhuǎn)基因株系T-Ⅱ中，CpTI基因的遺傳不符

8、合孟德爾規(guī)律?？瓜x試驗(yàn)表明，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)儲(chǔ)糧害蟲麥蛾的抗性有很大提高。轉(zhuǎn)基因株系T-Ⅰ、T-Ⅱ、T-Ⅲ的T1代PCR陽性植株所結(jié)實(shí)的T2代籽粒及陰性對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株籽粒，蟲蛀率分別為19.77％、21.86％、32.87％和58.27％，每一株系與對(duì)照相比都具有極顯著性差異，麥蛾蟲蛀率分別下降了66.07％、62.48％、43.59％。轉(zhuǎn)基因小麥抗麥蛾能力的增強(qiáng)，極大程度上是由于CpTI基因?qū)氲叫←溁蚪M中的緣故，而非來源于組織培