蛋白質(zhì)酶解歷程動態(tài)特性和多肽釋放規(guī)律研究.pdf

1、本文組合應(yīng)用色譜、質(zhì)譜、光譜等測試技術(shù)，系統(tǒng)地研究了兩個極具開發(fā)價值的水解體系：牛血紅蛋白-胃蛋白酶(體系Ⅰ)、牛乳酪蛋白-胰酶(體系Ⅱ)，并基于酶學(xué)性質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)知識，剖析酶解歷程動態(tài)特性和多肽釋放規(guī)律。 1.比較體系Ⅰ在兩種不同水解機制下的反應(yīng)行為。在pH為4.5時，牛血紅蛋白保持天然結(jié)構(gòu)，在胃蛋白酶作用下發(fā)生順次水解，底物在反應(yīng)過程中始終存在：在pH為2.0時，變性的牛血紅蛋白在胃蛋白酶作用下發(fā)生拉鏈水解，底物在反應(yīng)過程

2、中快速轉(zhuǎn)化為中間多肽。胃蛋白酶主要攻擊α鏈全鏈和β鏈兩端區(qū)域，而β鏈中部區(qū)域由于高親水性而少有剪切。基于多肽釋放動力學(xué)規(guī)律，確定活性多肽最佳制備工藝。進(jìn)一步根據(jù)胃蛋白酶水解特性和牛血紅蛋白結(jié)構(gòu)剖析了反應(yīng)行為。 2.跟蹤體系I活性多肽相互轉(zhuǎn)化歷程。在抗菌肽α107-136向血管舒緩激肽α110-125轉(zhuǎn)化歷程中，共涉及6個相關(guān)多肽；基于序列分析和多肽釋放動力學(xué)，構(gòu)建了反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，分析胃蛋白酶對各種肽鍵的親和力；依據(jù)結(jié)構(gòu)分析推斷多肽生

3、物學(xué)功能。 3.利用反相色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜對體系Ⅱ酶解產(chǎn)物多肽進(jìn)行分離。在酶解歷程中，產(chǎn)物多肽整體上按疏水性向親水性、多電荷向寡電荷、高分子量向低分子量轉(zhuǎn)變。 4.體系Ⅱ的底物和產(chǎn)物分析。酪蛋白在胰酶作用下，膠束含量逐漸降低，但膠束尺寸和分子量卻在水解10min內(nèi)不斷增加。反應(yīng)24小時內(nèi)，共釋放297個多肽。胰酶攻擊單體的速度從快到慢為：β酪蛋白＞αs1-酪蛋白＞αs2-酪蛋白＞κ-酪蛋白。 5.體

4、系Ⅱ酶解歷程的理論模擬和直觀表征。利用2-30-30-1的BP模型對酪蛋白酶解歷程分子量分布進(jìn)行模擬；基于該模型完成三維圖形表征，可直觀分析膠束區(qū)、單體區(qū)、巨肽區(qū)、長肽區(qū)和寡肽區(qū)的含量變化。 6.酪蛋白磷酸肽的特殊鑒定和釋放規(guī)律。采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合中性丟失掃描(SALSA自定義檢索模塊)和數(shù)據(jù)庫搜索(Sequest蛋白數(shù)據(jù)庫匹對)對酪蛋白磷酸肽(CPPs)進(jìn)行鑒定；CPPs在串聯(lián)質(zhì)譜過程均發(fā)生明顯的中性丟失現(xiàn)象，利用中性丟失峰