液固界面上蛋白質(zhì)遷移規(guī)律研究.pdf

1、蛋白質(zhì)分離純化是重組蛋白生產(chǎn)的瓶頸，高效液相色譜(high performance liquidchromatography，HPLC)是分離和純化蛋白，特別是制備規(guī)模上的最有效的方法，也是制藥工業(yè)中一種基本的分析和制備工具。蛋白質(zhì)的性質(zhì)與小分子不同，分離過程中，不僅會因分子大小的巨大差別，而且還會因分子構(gòu)象發(fā)生的變化，使兩者在色譜中保留行為存在很大差別。基于分離介質(zhì)功能團和蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同，優(yōu)化分離操作參數(shù)是費時且耗財?shù)倪^程。不同的樣

2、品中多肽，蛋白，小分子在色譜中的保留行為差別很大，所以，研究蛋白質(zhì)在色譜中的保留行為規(guī)律對于色譜分離的條件優(yōu)化和保留分子機理的研究有重要意義。本文研究內(nèi)容分為5部分： 1.文獻綜述：現(xiàn)有的描述蛋白色譜保留模型都是從小分子的色譜保留模型發(fā)展而來，在預(yù)測蛋白保留時間方面存在很大偏差。對現(xiàn)有的描述溶質(zhì)色譜保留模型進行綜述。共引用文獻148篇，其中近三年的文獻占到16％。 2.以疏水色譜柱為例，研究蛋白質(zhì)在疏水色譜(hydrop

3、hobic interactionchromatography，HIC)固定相界面上的遷移規(guī)律，對其保留時間和洗脫劑濃度、進樣時間等之間關(guān)系進行研究。首次發(fā)現(xiàn)梯度洗脫中，蛋白質(zhì)在分子構(gòu)象基本不發(fā)生變化的條件下，其保留時間可分為不隨進樣時間變化的直線部分和隨進樣時間變化的開始遷移部分，并首次提出蛋白質(zhì)在色譜中不連續(xù)遷移的概念。通過對該過程的自由能變化計算發(fā)現(xiàn)，對于同一根色譜柱，各種蛋白從開始遷移到完全洗脫的自由能變化為一定值，該自由能變化

4、的大小與所使用的色譜柱有關(guān)。最后利用大分子在HIC中的保留行為規(guī)律，進行大小分子的分離和緩沖溶液交換理論研究。 3.研究反相色譜(reversed phase liquid chromatography，RPLC）乙腈—水體系中，在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，甚至變性的條件下，研究了流速對分離度和遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RPLC中小分子溶質(zhì)的遷移速度隨流速變化大，蛋白質(zhì)類大分子溶質(zhì)遷移隨流速變化小。且溶質(zhì)的相對保留值與流速之間存在雙

5、對數(shù)線性關(guān)系。 4.研究了4根商品弱陰離子交換(weak—anion exchange chromatography，WAX)柱中存在的疏水相互作用機理。發(fā)現(xiàn)盡管存在的疏水作用強度不同，但是WAX中存在HIC機理是一個普遍現(xiàn)象。從分子機理上對該現(xiàn)象進行了解釋，利用計量置換理論(stoichiometric displacement theory，SDT)對該現(xiàn)象進行了驗證。 5.利用WAX柱中存在HIC機理進行了在線單柱