白菜型油菜多室基因BrCLV3功能研究.pdf

1、目前許多研究者通過選育多室角果材料來增加油菜每角果粒數(shù)和種子產(chǎn)量，然而有關(guān)油菜多室性狀的研究主要局限于遺傳規(guī)律以及結(jié)構(gòu)觀察等方面，對于多室基因的克隆以及多室角果形成的調(diào)控機理尚無研究報道。在我們前期研究中，通過圖位克隆的方法已將白菜型油菜黃籽沙遜中的多室基因ml4精細定位到38.6 kb范圍內(nèi)。在此基礎(chǔ)上本研究對其中的多室候選基因BrCL V3進行了功能驗證，并初步探討了多室角果形成的分子機制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對多室突

2、變體和兩室野生型的花器官、角果和莖頂端分生組織等結(jié)構(gòu)的變異進行了比較。與野生型相比，突變體的花器官變異主要表現(xiàn)為雄蕊和心皮數(shù)目增多;角果多為四室、呈短粗狀，大部分角果內(nèi)著生有額外的雌蕊;在整個發(fā)育時期，多室植株的莖頂端分生組織的面積都顯著增大，并且這種差異隨著植株的發(fā)育逐漸增大，表明多室角果的產(chǎn)生可能與莖頂端分生組織的增大有關(guān);不同發(fā)育時期的子房切片觀察結(jié)果表明，角果多室是由早期的多心皮雌蕊發(fā)育而來。
　　2.基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，B

3、rCL V3有3個外顯子和2個內(nèi)含子，共編碼94個氨基酸;氨基酸的N端存在一個信號肽，C端存在一個保守的CLE motif;等位基因的比較測序發(fā)現(xiàn)Brclv3等位基因是由BrCL V3的一個C/T單核苷酸突變產(chǎn)生的，并且該突變導(dǎo)致CLE motif的第9位脯氨酸突變成了亮氨酸。
　　3.構(gòu)建BrCL V3等位基因的超量表達載體和互補表達載體分別轉(zhuǎn)化擬南芥clv3-2突變體和白菜型油菜多室突變體，部分家系的多室角果可以恢復(fù)成兩室，證

4、實了Brclv3基因即為多室基因;另一方面，構(gòu)建Brclv3等位基因的超量表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥突變體clv3-2和野生型ler,在轉(zhuǎn)基因植株中未發(fā)現(xiàn)明顯的角果表型變化，表明Brclv3基因不具有拮抗效應(yīng)。
　　4.針對CLE motif中的SNP突變合成野生型多肽BrCLV3和突變型多肽BrCLV3Leu9，并對擬南芥和白菜型油菜進行體外處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型多肽能顯著抑制根、根頂端分生組織以及莖頂端分生組織的生長;而突變型多肽喪失了

5、這種抑制作用。該結(jié)果進一步證明了Brclv3中第9位脯氨酸突變成亮氨酸可以引起CLV3多肽活性的喪失，最終可能導(dǎo)致了油菜多室角果的產(chǎn)生。
　　5.以白菜型油菜多室突變體為輪回親本與和野生型雜交后反復(fù)回交，同時結(jié)合分子標記輔助選擇構(gòu)建多室/兩室性狀的近等基因系。在BC4F2代分離群體的初步分析發(fā)現(xiàn)，具有Brclv3隱性純合基因型的單株都為多室表型，并且相對于其它基因型單株，角果長度顯著縮短、每角果粒數(shù)和千粒重顯著增加。該結(jié)果表明Br