白菜型油菜種皮色澤基因的圖位克隆與功能分析.pdf

1、油菜是我國重要的油料作物，菜籽油是人們生活用油的主要來源。隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展，生活水平的不斷提高，對食用油品質(zhì)的要求也在日益提高。因此，油菜品質(zhì)育種逐漸成為現(xiàn)代油菜育種的重要組成部分。相同遺傳背景下，黃籽油菜較黑籽油菜具有種皮薄、纖維素含量低、含油量高、餅粕蛋白質(zhì)含量高等諸多優(yōu)點。同時其榨取的菜籽油雜質(zhì)少、清澈透明，易受消費者青睞，業(yè)已成為油菜品質(zhì)育種中優(yōu)良的種質(zhì)資源。但大面積種植的甘藍型油菜中并不存在天然的黃籽材料，使得這一優(yōu)良性狀在

2、實際生產(chǎn)中的推廣應用成為難題。目前很多科學家利用油菜的近緣種來創(chuàng)造甘藍型油菜黃籽種質(zhì)。白菜型油菜作為栽培油菜基本種，蘊含著豐富的黃籽資源，是創(chuàng)建甘藍型油菜黃籽種質(zhì)的重要物種之一。本研究通過白菜型黃籽油菜種皮色澤基因的克隆與功能分析，探討了白菜型黃籽油菜形成的生物學基礎。主要內(nèi)容如下:
　　 1.初步定位顯示，白菜型油菜種皮色澤基因位于A9連鎖群SSR標記Lsr126與bsr1之間。在此基礎上，利用http:∥brassicadb

3、.org/brad/網(wǎng)站提供的白菜Scaffold序列信息，開發(fā)與目標基因共分離的SSR標記，最終鎖定目標基因區(qū)段。該區(qū)段與擬南芥基因組同源線性比對分析顯示，共包含at4g09820到at4g10620共計22個擬南芥同源基因。
　　 2.依據(jù)目標基因區(qū)段與擬南芥線性比對結(jié)果及白菜型油菜IP引物群體驗證，選定BrTT8基因為候選基因。利用Tail技術(shù)和白菜基因組序列信息，設計特異引物TuL1/R1，對白菜型油菜BrTT8基因進行

4、全長擴增。
　　 3.等位基因序列分析顯示，在近等基因系黃籽材料中BrTT8基因內(nèi)存在大片段序列插入。插入序列分析表明，該序列具有新型轉(zhuǎn)座子Helitron的結(jié)構(gòu)特征:插入序列位于保守堿基AT之間，5'端起始于TC，3'末端結(jié)束于CTAG，在3'端上游6bp處有一段17bp長的回文序列。
　　 4.BrTT8基因在白菜型油菜近等基因系黑、黃籽材料中表達差異檢測顯示，黃籽材料開花后10天、20天、30天的種子中均未檢測到B

5、rTT8基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而在黑籽材料中BrTT8基因正常轉(zhuǎn)錄。
　　 5.BrTT8基因全序列提交http:∥www.expasy.org/tools/protparam/網(wǎng)站進行蛋白結(jié)構(gòu)預測，結(jié)果顯示BrTT8蛋白包含520個氨基酸，分子量為59.5 kD，其編碼一個bHLH蛋白，蛋白羧基端附近有一個典型的bHLH結(jié)構(gòu)域。
　　 6.利用農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法，將BrTT8基因轉(zhuǎn)入擬南芥tt8-1突變體，最終獲得25個表型

6、恢復的T1代擬南芥轉(zhuǎn)化株。同時通過香草醛染色分析，轉(zhuǎn)基因植株表型恢復源于原花色素在種皮的積累。由此說明，BrTT8基因有著與擬南芥TT8基因相似的功能，都參與了原花色素合成途徑。
　　 7.白菜型油菜近等基因系黑、黃籽材料間，類黃酮途徑結(jié)構(gòu)基因Real-Time PCR分析顯示，在黃籽材料中，晚期結(jié)構(gòu)基因BrDFR、BrBAN表達量明顯下降。但早期結(jié)構(gòu)基因BrTT6和BrTT7的表達量在黑、黃籽材料間沒有顯著差異。以上說明在白菜

7、型油菜中，BrTT8同樣參與了類黃酮途徑晚期結(jié)構(gòu)基因的表達調(diào)控。
　　 8.對白菜型油菜近等基因系黑、黃籽材料，發(fā)育中的種子切片觀察發(fā)現(xiàn)，在白菜型油菜黑籽材料中原花色素經(jīng)過染色處理后，可以形成紅色小顆粒沉積于內(nèi)種皮細胞層中，而在黃籽材料種皮細胞中，則沒有原花色素的沉積。而且，原花色素積累的細胞層在黃籽材料中已不復存在，取而代之的是細胞殘片類似物，散落在內(nèi)種皮細胞層間。但在擬南芥tt8-1突變體與野生型擬南芥的種皮結(jié)構(gòu)顯微觀察發(fā)現(xiàn)

8、，突變體tt8-1內(nèi)種皮與野生型相比，只存在色素積累的差別，并沒有細胞層結(jié)構(gòu)的變化。推測白菜型油菜BrTT8基因與擬南芥TT8基因在功能上雖然相似，但并非完全相同。
　　 9.白菜型油菜黃籽沙遜是甘藍型黃籽油菜No.2127-17重要親本之一，但在以No.2127-17為親本的近等基因系群體間BrTT8并未表現(xiàn)出多態(tài)性，說明甘藍型油菜No.2127-17種皮色澤性狀相關(guān)的N9連鎖群上的主效QTL位點并非是BrTT8基因位點。

9、r>　　 綜上所述，通過白菜型油菜種皮色澤相關(guān)基因BrTT8的克隆及功能分析，可初步將白菜型油菜黃籽沙遜與黑籽材料3H129所構(gòu)建的近等基因系群體中，種皮色澤分離的分子機制概括如下:在該群體中，黃籽材料BrTT8基因由于轉(zhuǎn)座子的大片段插入，引起了BrTT8基因序列的突變，從而導致這一重要轉(zhuǎn)錄因子功能的紊亂，使得類黃酮代謝途徑中晚期結(jié)構(gòu)基因不能正常轉(zhuǎn)錄，原花色素合成受阻，繼而不能在黃籽材料內(nèi)種皮中積累色素，最終種皮呈現(xiàn)無色透明，種子發(fā)育