后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型的建立及新型核苷-聯(lián)苯雙酯化合物α-DDB-DU抗HBV藥效學(xué)研究.pdf

1、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引起的一種常見的、嚴(yán)重的肝臟疾病。盡管一些抗病毒藥物如拉米夫定(Lamivudine，3TC)、阿德福韋酯(Adefovir, ADV)等能夠有效的抑制乙肝病毒復(fù)制，慢性乙肝仍然是一種無(wú)法徹底治愈的疾病。目前，在抗乙肝病毒治療中核苷類藥物起著關(guān)鍵作用。但是，長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥和毒副作用，這可能導(dǎo)致治療失敗、肝臟疾病的發(fā)展。因此，尋找療效顯著、低毒副作用的新型抗HB

2、V藥物仍然具有重要意義。鴨乙型肝炎(Duck hepatitis B virus，DHBV)模型是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的一種評(píng)價(jià)抗HBV藥物的體內(nèi)動(dòng)物模型。本文首先建立了河南地區(qū)后天感染麻鴨乙肝病毒模型，然后采用HepG2.2.15細(xì)胞為體外模型，評(píng)價(jià)新型核苷類藥物α-DDB-DU的體外抗病毒活性;采用建立的鴨乙肝模型為體內(nèi)模型，評(píng)價(jià)α-DDB-DU的體內(nèi)抗病毒活性及保肝作用。
　　 第一部分:后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型的建立。

3、r>　　 目的:建立河南麻鴨乙型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)模型，并初步觀察拉米夫定(3TC)體內(nèi)抗DHBV作用。
　　 方法:篩選3日齡DHBV陰性河南麻鴨，經(jīng)脛靜脈注射DHBV陽(yáng)性血清，連續(xù)觀察42天，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorsescence quantitative polymerase chainreaction，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)鴨血清和肝臟中DHBV DNA變化情況。隨后用3TC對(duì)建立的模型進(jìn)行初步應(yīng)用。模型組給予生

4、理鹽水2ml/kg·d，3TC組給予3TC20mg/kg·d，連續(xù)給藥10天。FQ-PCR檢測(cè)給藥后5天、10天及停藥后3天血清和肝臟中DHBV DNA抑制率，并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:感染2d后，血清和肝臟中均可檢測(cè)到DHBV DNA。血清第14天達(dá)到高峰，肝臟第21天達(dá)到高峰，在42天內(nèi)均維持較高的DHBV DNA水平。3TC用藥10天后，血清和肝臟HBV DNA抑制率分別為86.47％和84.92％，肝組織炎性病

5、變較模型組明顯減輕，但停藥3天有輕度“反跳”現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:河南麻鴨后天感染DHBV較敏感，病毒在體內(nèi)增殖穩(wěn)定，是DHBV感染的理想疾病模型，該模型可用于抗HBV藥物的篩選和評(píng)價(jià)。
　　 第二部分:新型核苷-聯(lián)苯雙酯化合物α-DDB-DU抗HBV作用研究。
　　 目的:探討新型核苷類化合物α-DDB-DU體內(nèi)和體外抗乙肝病毒作用。
　　 方法:α-DDB-DU體外抗病毒活性的研究選用能夠合成、分泌HB

6、V顆粒和表達(dá)HBV抗原標(biāo)志物的HepG2.2.15細(xì)胞株為模型，采用MTT法檢測(cè)不同濃度α-DDB-DU的細(xì)胞毒性;酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)不同濃度α-DDB-DU對(duì)細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的抑制作用;FQ-PCR法檢測(cè)α-DDB-DU對(duì)細(xì)胞內(nèi)外HBV DNA水平的抑制作用。體內(nèi)抗病毒活性的研究采用已建立的后天感染河南麻鴨乙肝病毒模型。感染后，DHBV陽(yáng)

7、性鴨隨機(jī)分成5組，藥物組給予不同劑量的α-DDB-DU（0.8、4和20 mg/kg·d），陽(yáng)性對(duì)照組給與3TC20mg/kg·d，模型組與陰性對(duì)照組給予生理鹽水2ml/kg·d，連續(xù)給藥10天。在第5、10和停藥后第3天，收集血清和肝組織樣品，檢測(cè)血清和肝臟中DHBV DNA及ALT(Alanine Aminotransferase)、AST(Aspartate Amintransferase)的水平。用藥10天后，對(duì)肝臟進(jìn)行組織病理

8、學(xué)觀察。
　　 結(jié)果:α-DDB-DU對(duì)HepG2.2.15的半數(shù)毒性濃度(CC50)為436.16μM。不同濃度的該化合物（0.2μM、1μM、5μM）作用于細(xì)胞，能夠顯著的抑制s抗原和e抗原的分泌，抑制作用與時(shí)間和劑量呈正相關(guān)。α-DDB-DU濃度為5μM時(shí)，能夠有效地抑制HBV DNA的復(fù)制。藥物作用第九天，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外DHBV DNA抑制率分別為81.18％和88.55％。給予不同劑量α-DDB-DU(0.8，4，20