關(guān)于坐骨神經(jīng)再生的機(jī)理.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷和缺損的治療是顯微外科的難題之一。不少學(xué)者從不同角度，采用多種方法進(jìn)行了有益的探索，取得了很大的進(jìn)展。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)的興起，對(duì)周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)探索出一條解決問(wèn)題的捷徑。研制可生物降解的人工神經(jīng)套管，將此套管植入缺損神經(jīng)的近端和遠(yuǎn)端之間，將兩端神經(jīng)連接起來(lái)，在它們之間構(gòu)建一個(gè)有利于神經(jīng)再生的“微環(huán)境”，誘導(dǎo)損傷神經(jīng)的再生與修復(fù)，將是很有前途的方法。目前，用于套接的材料很多，分兩大類，一類是合成材料，另一類是天然材料。

2、勞杰等證明用硅膠管，并輔以施萬(wàn)細(xì)胞，能誘導(dǎo)正中神經(jīng)再生。硅膠管有制備方便、不塌陷的優(yōu)點(diǎn)，但術(shù)后會(huì)產(chǎn)生致命的神經(jīng)卡壓現(xiàn)象及炎性刺激，另外需要再次手術(shù)取出，所以并不適合臨床應(yīng)用。靜脈管壁做為套管容易塌陷，而且其中的成纖維細(xì)胞易形成疤痕，阻礙神經(jīng)生長(zhǎng)。膠原膜套管具有排異反應(yīng)小，可吸收、存儲(chǔ)方便的特點(diǎn)，適合臨床應(yīng)用。王光林等以雪旺細(xì)胞與PLA構(gòu)建組織工程化人工神經(jīng)，修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的效果接近于自體神經(jīng)移植。 第一軍醫(yī)大學(xué)自1991年以來(lái)

3、，采用經(jīng)序貫生物化學(xué)特殊處理的人發(fā)角蛋白(humanhairkeratin,HHK)為醫(yī)學(xué)生物材料，成功研制出HHK人工腱。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床應(yīng)用證明，該人工腱不僅具有其它傳統(tǒng)醫(yī)用材料的生物學(xué)特性，而且還具有以下特點(diǎn)：組織相容性好；可完全降解吸收，并能誘導(dǎo)形成具有正常功能的自體腱形成，從而表明HHK可以作為一種新型的醫(yī)用生物材料應(yīng)用于臨床。 研究表明，將HHK制成套管，套接于離斷的坐骨神經(jīng)兩端，發(fā)現(xiàn)HHK套管能橋接缺損的外周神經(jīng)，

4、使損傷的周圍神經(jīng)修復(fù)再生，肢體功能恢復(fù)正常；而且還發(fā)現(xiàn)連接于神經(jīng)斷端、起定向作用的HHK絲上有大量的施萬(wàn)細(xì)胞附著。在HHK誘導(dǎo)自體腱形成的研究也發(fā)現(xiàn)，植入的HHK絲上有大量的腱細(xì)胞附著，說(shuō)明HHK具有良好的細(xì)胞附著性。但是HHK誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)再生的機(jī)理還不清楚，在該研究中應(yīng)用HE染色，免疫組織化學(xué)，電鏡等方法系統(tǒng)的觀察了HHK誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)再生時(shí)的形態(tài)學(xué)變化，以揭示其誘導(dǎo)神經(jīng)再生機(jī)理。 HHK神經(jīng)套管還存在著一些缺點(diǎn)，如中空的管腔存

5、在著較大的間隙；管腔內(nèi)無(wú)橋接體，不利于雪旺細(xì)胞的附著；HHK套管壁的孔隙太大，不能有效地在損傷局部聚集高濃度的細(xì)胞因子，不能有效的防止成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)，不利于神經(jīng)的再生。為此，為了進(jìn)一步改進(jìn)和完善HHK神經(jīng)套管，該文將可降解的HHK為支架材料，以雪旺細(xì)胞為種子細(xì)胞，構(gòu)建組織工程化神經(jīng)，用于周圍神經(jīng)損傷的再生修復(fù)。該文在HHK套管腔內(nèi)充填HHK絲，建立橋接體，為細(xì)胞提供附著體，有效地引導(dǎo)神經(jīng)再生。然而，充填HHK絲量多少為宜，如何調(diào)控它們

6、的降解，使其在適宜的時(shí)間內(nèi)降解，都需要進(jìn)一步研究。如果HHK絲過(guò)早吸收則不能引導(dǎo)神經(jīng)再生，吸收太慢則會(huì)使材料滯留體內(nèi)，對(duì)再生的神經(jīng)產(chǎn)生局部壓迫作用。HHK具有快速、中速和慢速3個(gè)降解組分，所以調(diào)控HHK橋接體的降解是可行的。先前構(gòu)建的HHK神經(jīng)套管管壁孔隙太大，擬將管外壁附以膠原膜復(fù)合材料，構(gòu)建具有屏障作用的半透膜。一方面可以在局部聚集有效濃度的細(xì)胞因子，另一方面有效地防止成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)，防止疤痕形成，產(chǎn)生有效誘導(dǎo)神經(jīng)再生的“微環(huán)境”

7、。關(guān)于種子細(xì)胞施萬(wàn)細(xì)胞以何種形式構(gòu)建組織工程化神經(jīng)，現(xiàn)在還存在著分歧，為此，擬將基因修飾和未修飾的施萬(wàn)細(xì)胞分別用于神經(jīng)的構(gòu)建，進(jìn)而評(píng)價(jià)其效果。 該研究分為二章。 第一章體內(nèi)HHK誘導(dǎo)大鼠損傷的坐骨神經(jīng)再生的形態(tài)學(xué)機(jī)理 目的 觀察HHK絲束橋接體誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)再生過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化，以揭示坐骨神經(jīng)再生機(jī)理。同時(shí)比較HHK復(fù)合膠原膜對(duì)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)再生的效果 方法 制備坐骨神經(jīng)損傷SD大鼠動(dòng)物模

8、型，分別植入HHK或HHK+膠原屏障膜，于術(shù)后2d、1、3、6、9、12周取材進(jìn)行HE染色，免疫組織化學(xué)染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。 結(jié)果 大體觀察：HHK實(shí)驗(yàn)組術(shù)后傷口愈合良好，無(wú)排異反應(yīng)。HHK絲束橋接體植入體內(nèi)1周后，肉眼觀察神經(jīng)缺損處兩組表現(xiàn)相同；植入3周后，HHK絲束橋接體部分降解。植入后9周，HHK絲束橋接體周圍施萬(wàn)細(xì)胞增多，HHK減少。植入后12周，可見(jiàn)HHK絲束已被明顯降解吸收，新生神經(jīng)與正常神經(jīng)接頭處已牢固的

9、融合在一起。HHK+膠原屏障膜實(shí)驗(yàn)組則發(fā)現(xiàn)有堅(jiān)硬的隆起。切開(kāi)膠原屏障膜后發(fā)現(xiàn)由HHK誘導(dǎo)所形成的外膜隆起。組織學(xué)觀察：術(shù)后第2d到1周，切除后遠(yuǎn)、近端的施萬(wàn)細(xì)胞發(fā)生去分化，沿著HHK束表面縱向分裂增殖。術(shù)后第3周HHK開(kāi)始降解，施萬(wàn)細(xì)胞大量增生。HHK周圍可見(jiàn)很多巨噬細(xì)胞和多核巨細(xì)胞，并有軸突和大量微血管出現(xiàn)。術(shù)后第6周，在HHK絲周圍可見(jiàn)大量新生的神經(jīng)纖維。術(shù)后第9周，HHK降解顯著，有明顯的神經(jīng)外膜和束膜。術(shù)后第12周，HHK基本完

10、全降解，其部位被新的神經(jīng)纖維所取代。HHK絲束+膠原膜屏障膜組與HHK絲束組在形態(tài)上沒(méi)有明顯的區(qū)別。 第二章體外HHK組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建 第一節(jié)β-NGF、BDNF的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建 目的 為了提高SC分泌NGF及BDNF的活性，提取大鼠全腦RNA，克隆β-NGF基因、BDNF基因，同時(shí)構(gòu)建其真核表達(dá)載體。 方法 從正常新生大鼠腦中提取全腦總RNA，以此總RNA為模板，應(yīng)用RT

11、-PCR兩步法擴(kuò)增神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因和腦源性營(yíng)養(yǎng)因子基因，把得到的基因片段分別重組到pUCm-T上，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定得到含有大鼠的神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因和腦源性營(yíng)養(yǎng)因子基因的克隆。再將得到的基因分別重組到真核表達(dá)載體pEGFP-C2上，構(gòu)建其真核表達(dá)載體。 結(jié)果 成功的克隆了大鼠β-NGF、BDNF基因，并分別構(gòu)建了這兩個(gè)基因的真核表達(dá)載體。 第二節(jié)基因修飾施萬(wàn)細(xì)胞與體外神經(jīng)的構(gòu)建 目的 應(yīng)用可吸收生物

12、材料人發(fā)角蛋白復(fù)合β-NGF及BDNF基因修飾的新生大鼠施萬(wàn)細(xì)胞制備體外組織工程化神經(jīng)。 方法 應(yīng)用雙酶消化法及差速貼壁法原代分離培養(yǎng)施萬(wàn)細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將β-NGF及BDNF真核表達(dá)載體導(dǎo)入施萬(wàn)細(xì)胞中，G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞，將HHK與陽(yáng)性細(xì)胞共培養(yǎng)，研究其組織相容性。 結(jié)果 成功分離到新生大鼠施萬(wàn)細(xì)胞，S-100蛋白標(biāo)記SC細(xì)胞，純度達(dá)到96％。成功的分別將β-NGF及BDNF真核表達(dá)載體導(dǎo)入施

13、萬(wàn)細(xì)胞中。并將HHK與基因修飾的施萬(wàn)細(xì)胞共培養(yǎng)，細(xì)胞貼附在HHK上，生長(zhǎng)良好，證實(shí)其有良好的生物相容性。將共培養(yǎng)的HHK和基因修飾的施萬(wàn)細(xì)胞放入人發(fā)角蛋白套管中，構(gòu)建成體外人發(fā)角蛋白組織工程化神經(jīng)。 結(jié)論 1、該研究通過(guò)HHK絲束復(fù)合膠原膜修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷，證實(shí)HHK絲束是理想的神經(jīng)再生的橋接體，它起到了神經(jīng)再生過(guò)程中基膜管的作用。同時(shí)坐骨神經(jīng)再生時(shí)會(huì)自身在HHK絲束周圍由結(jié)締組織形成一屏障膜，無(wú)需在HHK絲外加屏障

14、膜。 2、神經(jīng)再生是從受損軸突潰變的清除生長(zhǎng)錐的發(fā)生，施萬(wàn)細(xì)胞髓鞘通過(guò)自噬、降解、胞質(zhì)脫落、外排的形式清除，變?yōu)槿シ只氖┤f(wàn)細(xì)胞，其中胞質(zhì)脫落是去分化最重的一環(huán)。受損軸突立即發(fā)生保護(hù)性封閉、脫落。健康軸突形成膨大的帶突起的生長(zhǎng)錐，生長(zhǎng)錐突起上伸出許多絲狀生長(zhǎng)芽，并與1到多個(gè)施萬(wàn)細(xì)胞嵌合，它們通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性選擇，最后只有一條生長(zhǎng)芽可發(fā)育成完整的軸突。神經(jīng)外膜、束膜、內(nèi)膜是由血管屏障膜、纖維屏障膜演變而來(lái)的，它們是神經(jīng)再生的重要環(huán)境因素