抵抗素對(duì)血管內(nèi)皮功能的作用及不同干預(yù)方法保護(hù)內(nèi)皮功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的心血管疾病。目前被普遍接受的Ross“損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，血管內(nèi)皮功能障礙(endothelial dysfuction，ED)是動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期始動(dòng)環(huán)節(jié)，并且貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程。研究證實(shí)，內(nèi)皮功能障礙的程度還是預(yù)測(cè)急性心血管事件的重要標(biāo)志。因此早期檢測(cè)內(nèi)皮功能障礙的危險(xiǎn)因子及其引發(fā)內(nèi)皮功能障礙的可能機(jī)制，對(duì)于預(yù)防

2、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有重要意義。 研究方法： 1、外源性高抵抗素血癥模型建立，觀察外源性高抵抗素對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。4周齡SD大鼠16只，隨機(jī)分為抵抗素(RE)組與生理鹽水對(duì)照(NS)組，各8只。抵抗素組大鼠在禁食10小時(shí)后給予尾靜脈注入重組大鼠抵抗素(Phoenix Pharmaceuticals Ltd，美國(guó))10μg，2小時(shí)后第二次給予10μg抵抗素，作為短期高抵抗素血癥模型。生理鹽水對(duì)照組在相同時(shí)間給予等容量

3、生理鹽水尾靜脈注射。于第二次注藥2小時(shí)后腹腔麻醉，留取血液及組織標(biāo)本。比較兩組抵抗素、胰島素、血管內(nèi)皮分泌因子、血脂等血液指標(biāo)以及主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達(dá)差異。 2、內(nèi)源性高抵抗素血癥模型建立，觀察內(nèi)源性高抵抗素對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響。4周齡SD大鼠130只，隨機(jī)分為高脂組122只，正常對(duì)照組(NC組)8只。高脂組大鼠飼高脂飼料，正常對(duì)照組飼基礎(chǔ)飼料。高脂組給予高脂飼料飼養(yǎng)8周后，高脂組與正常對(duì)照組大鼠空腹頸

4、靜脈采血，測(cè)血清抵抗素水平。①高脂組中血清抵抗素大于正常對(duì)照組-X+2s的大鼠共52只，從中隨機(jī)選取大鼠40只并分為飲食誘導(dǎo)高抵抗素血癥組(HRE組，n=8)及其他四種干預(yù)組(32只，詳見(jiàn)研究方法3)。②高脂組中血清抵抗素低于正常對(duì)照組X+s的大鼠共24只，從中隨機(jī)選取8只作為高脂飲食正常抵抗素組(NRE組，n=8)。將篩選出的高抵抗素血癥組(HRE組)、正常抵抗素組(NRE組)與正常對(duì)照組(NC組)各自按原喂養(yǎng)方法繼續(xù)喂養(yǎng)8周。8周后

5、禁食麻醉，留取血液及組織標(biāo)本。比較三組間抵抗素、胰島素、血管內(nèi)皮分泌因子、血脂等血液指標(biāo)以及主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達(dá)差異。 3、不同干預(yù)方法的效果比較。高脂組中(見(jiàn)研究方法2)血清抵抗素大于正常對(duì)照組(NC)X+2s的大鼠共52只，從中隨機(jī)選取大鼠40只并分為飲食誘導(dǎo)高抵抗素血癥組(HRE組，n=8)及四種干預(yù)組，分別為單純調(diào)整飲食組(DC組，n=8)、運(yùn)動(dòng)+調(diào)整飲食組(SW組，n=8)、羅格列酮+調(diào)整飲食

6、組(RO組，n=8)、抗體+調(diào)整飲食組(AB組，n=8)。正常對(duì)照組采用研究方法2中正常對(duì)照組(NC組，n=8)。 DC組將高脂飼料改為基礎(chǔ)飼料，不采取其他措施；SW組采用無(wú)負(fù)重游泳方式，每周游泳5次，每次1小時(shí)，水溫29±2℃，喂基礎(chǔ)飼料；RO組給馬來(lái)酸羅格列酮(Rosiglitazone)(葛蘭素史克公司生產(chǎn)，文迪雅)2mg/(Kg·d)，灌胃，喂基礎(chǔ)飼料。AB組每日給予抵抗素抗體(Biovendor Laboratory

7、Medicine，Inc.德國(guó))500ug尾靜脈注射，共3天，飲食改為基礎(chǔ)飼料；高抵抗素血癥組不采取干預(yù)措施，繼續(xù)高脂飲食至試驗(yàn)結(jié)束。干預(yù)持續(xù)8周后，禁食麻醉，留取血液及組織標(biāo)本待測(cè)。比較上述各組抵抗素、胰島素、血管內(nèi)皮分泌因子、血脂等血液指標(biāo)以及主動(dòng)脈內(nèi)皮eNOS、ET、PI3K、AKT表達(dá)差異。 4、血液指標(biāo)測(cè)定： 采用ELISA法測(cè)量外周血抵抗素、血漿纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、von Willebran

8、d因子(vWF)；放免法測(cè)內(nèi)皮素(ET)、胰島素(INS)；硝酸還原酶法測(cè)一氧化氮(NO)；利用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血脂：膽固醇(CH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)：AI=(TC-HDL)/HDL。 5、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮eNOS、ETmRNA表達(dá)；分別以eNOS、ET擴(kuò)增條帶吸光度比值(eNOS/actin、ET/

9、actin)作為其表達(dá)強(qiáng)度。 6、免疫組化法檢測(cè)胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮磷脂酰激醇3激酶(PI3K)p85α亞基、絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白激酶B(Akt)-1蛋白表達(dá)。 7、原位雜交法檢測(cè)胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮PI3Kp85α、Akt-1 mRNA表達(dá)。 8、采用計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)計(jì)算原位雜交及免疫組化圖像中血管內(nèi)皮層陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞積分光密度(IOD)，作為PI3K與Akt的表達(dá)強(qiáng)度。 9、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，

10、采用SPSS14.0軟件分析；兩組之間比較用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較用方差分析。試驗(yàn)指標(biāo)均經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的指標(biāo)之間進(jìn)行person相關(guān)分析與partial相關(guān)分析(控制混雜因素后進(jìn)行相關(guān)分析)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)論 1、外源性注射大鼠重組抵抗素后，試驗(yàn)大鼠出現(xiàn)明顯血管內(nèi)皮分泌功能紊亂，伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞活化通路信號(hào)PI3K、AktmRNA與蛋白表達(dá)的下降。 2、高脂飲食喂養(yǎng)大鼠可以誘導(dǎo)內(nèi)

11、源性高抵抗素血癥模型及正常抵抗素大鼠。高抵抗素血癥大鼠血清抵抗素水平與脂肪組織抵抗素表達(dá)均顯著高于正常抵抗素大鼠。二者都有肥胖、血脂紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)升高及不同程度的胰島素抵抗現(xiàn)象。 3、高脂飲食誘導(dǎo)高抵抗素大鼠血管內(nèi)皮分泌功能紊亂的程度顯著高于高脂飲食正常抵抗素大鼠。高脂飲食誘導(dǎo)高抵抗素大鼠與高脂飲食正常抵抗素大鼠比較，血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K、Akt的mRNA與蛋白表達(dá)均顯著降低。 4、肥胖個(gè)體中抵抗素升高與血管內(nèi)皮

12、功能障礙同步發(fā)生，提示血清抵抗素檢測(cè)可以作為肥胖個(gè)體血管內(nèi)皮功能障礙的早期預(yù)測(cè)指標(biāo)。 5、控制體重、Lee指數(shù)、胰島素、血糖、血脂等因素的影響后，血清抵抗素、抵抗素mRNA與內(nèi)皮分泌因子顯著相關(guān)，與PI3K、Akt的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。提示抵抗素通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路引起了血管內(nèi)皮分泌功能紊亂。 6、調(diào)整飲食、運(yùn)動(dòng)、羅格列酮、抗體四種方法均可以使血管內(nèi)皮分泌功能有不同程度改善，伴有血管內(nèi)皮PI3K、Akt的mRNA與蛋白表達(dá)升

13、高。其中運(yùn)動(dòng)+調(diào)整飲食或羅格列酮+調(diào)整飲食的干預(yù)效果最好。 創(chuàng)新和意義： 1、在體證實(shí)了抵抗素有引發(fā)血管內(nèi)皮分泌功能障礙的作用。首次比較了高脂飲食狀態(tài)下，不同抵抗素水平個(gè)體血管內(nèi)皮分泌功能的差異；證實(shí)了在排除混雜因素后抵抗素是誘導(dǎo)血管內(nèi)皮分泌功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提出早期檢測(cè)并干預(yù)抵抗素是預(yù)防血管內(nèi)皮功能障礙的重要環(huán)節(jié)。 2、首次在體研究了抵抗素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活化通路PI3K/AKT蛋白的作用，比較了不同抵抗素水平