蘿卜細胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)和核基因的分子標記的開發(fā)及其分子特征.pdf

1、蘿卜是深受世界人民喜愛的根菜類蔬菜。蘿卜的雜種優(yōu)勢非常顯著，能夠有效地提高產(chǎn)量和改善纖維品質(zhì)。在植物中，細胞質(zhì)雄性不育(CMS)是一種不能產(chǎn)生正常功能花粉的母性遺傳性狀，被廣泛地應用于商業(yè)化生產(chǎn)F<,l>代雜種。蘿卜CMS系的細胞質(zhì)即能導致蘿卜屬植物雄性不育，又能導致蕓薹屬植物雄性不育，而且其CMS不易受環(huán)境條件和不同遺傳背景的影響，從而是十字花科植物中最受關(guān)注的不育細胞質(zhì)之一。目前已有一種蘿卜CMS及其對應的恢復位點從蘿卜導入到油菜中

2、，但一些不良的農(nóng)藝性狀隨著恢復基因的導入而出現(xiàn)。遠期目標在于闡明蘿卜CMS及育性恢復以及使蘿卜CMS在十字花科雜種優(yōu)勢育種中得到充分利用。本篇論文中，就蘿卜CMS胞質(zhì)不育和核基因的分子標記及其分子特征進行了描述。取得的主要研究結(jié)果如下： 獲得了一個蘿卜CMS系統(tǒng)，該系統(tǒng)由雄性不育系9802A、保持系9802B和恢復系9802H組成。該不育系花藥外觀皺縮或正常，無可見花粉，而Ogu CMS系花藥外觀皺縮未完全發(fā)育；NWB　CMS系

3、則花藥外觀正常、花藥內(nèi)有部分花粉。不育系9802A和恢復系9802H雜交產(chǎn)生的F<,l>植株全部表現(xiàn)雄性可育，表明CMS的恢復表現(xiàn)型是一種顯性性狀。獲得了由300個單株組成的F<,2>代育性分離群體?？ㄆ椒綔y驗表明分離群體中可育與不育的分離比符合3:1的比例，證明9802A雄性不育的育性恢復受單一顯性基因控制。 用蘿卜Ogu orf138基因的特異引物組合ORF-F和ORF-R，在蘿卜CMS系9802A總DNA中擴增出了一條DN

4、A片段，而在保持系9802B和恢復系9802H中未擴增出任何產(chǎn)物。序列分析表明該片段與特異誘導Ogu CMS相關(guān)基因orf138序列完全一致。該DNA片段可以作為選育蘿卜CMS的分子標記。 合成了能夠擴增出蘿卜NWB CMS系的特異分子標記的引物組合NWB-F和NWB-R，該引物組合在蘿卜CMS保持系9802B和恢復系9802H總DNA中擴增出了單一DNA片段，而在CMS系9802A總DNA中未擴增出任何產(chǎn)物。該DNA片段可以作

5、為輔助選育蘿卜CMS保持系的分子標記。 采用混合分群分析法和F<,2>代的300個單株篩選了蘿卜CMS恢復基因Rfw的RAPD標記。對100條RAPD引物的擴增產(chǎn)物進行篩選后，發(fā)現(xiàn)RAPD標記OPC06-1900與恢復基因Rfw連鎖。通過分子克隆和核苷酸測序?qū)⒃揜APD標記轉(zhuǎn)換成了顯性的SCAR標記SCC06-1894。BLAST搜索表明SCC06-1894與擬南芥和甘藍硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的對應區(qū)域高度同源。設(shè)計了等位特異引物，

6、擴增出了SCAR標記SCC06-415。用F<,2>代的分離群體進行PCR分析及序列分析表明SCC06-1894和SCC06-415等位，與Rfwlrfw的遺傳距離為8.0cM。根據(jù)一個蘿卜細胞質(zhì)雄性不育恢復基因mRNA的序列信息，設(shè)計了9條引物。采用混合分群分析法篩選這些引物構(gòu)成的引物組合，鑒別出了3個多態(tài)性帶，這3個PCR分子標記相互間處于相引相，且共分離，與恢復基因Rfw遺傳距離為1.4 cM。以上的特異的分子標記分布在恢復基因R

7、fw的兩翼有助于選育新的油菜恢復系。 通過PCR、RT-PCR和測序發(fā)現(xiàn)了與Ogu CMS恢復基因Rfo完全一致的mRNA及基因組序列?；谝陨辖Y(jié)果，推斷恢復基因Rfw與Rio處在蘿卜基因組的不同區(qū)域但緊密連鎖(遺傳距離為1.4 cM)。首次通過分子標記手段鑒定出了蘿卜cMS新的恢復位點。 通過RT-PcR和RACE技術(shù)克隆出了Rfo-like基因的cDNA，推導的氨基酸序列與Rfo蛋白擁有97％的一致性。RT-PCR分

8、析表明Rfo-lidk基因在蘿卜的根、薹、葉、花和嫩莢中均有表達。Rfo-like基因可能是一個新的蘿卜CMS恢復基因。 基于恢復基因Rfw連鎖分子標記SCC06-1894的序列信息，從蘿卜中首次克隆出了推測的硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因RSultr3.2A，該基因編碼651個氨基酸的多肽，預測的分子量為71701 Da。推測的氨基酸序列含有硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族所具有的保守結(jié)構(gòu)域，與其它植物硫酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白具有很高的同源性，該基因的表達不受缺

9、硫的影響，在蘿卜的根、薹、葉、花和嫩莢中均有表達，暗示植物可能需要一個非調(diào)節(jié)性的組成型表達的系統(tǒng)。該基因在蘿卜基因組中為單拷貝。通過PCR和測序獲得了RSultr3.2A的基因組序列信息，與RSultr3.2A的eDNA序列比對表明該基因擁有12個外顯子和11個內(nèi)含子組成。RSultr3.2.4是否由蘿卜滲入到油菜中并是否參與控制了對油菜不利的性狀，有待進一步研究。此外，從蘿卜嫩莢中發(fā)現(xiàn)了cDNARSultr3.2B，編碼由499個氨基