Der p2重組BCG疫苗調(diào)控哮喘小鼠DC表型及功能的研究.pdf

1、目前認(rèn)為，體內(nèi)Th1/Th2失衡，Th2優(yōu)勢(shì)是哮喘重要的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制之一。對(duì)過(guò)敏原的免疫不耐受性在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用是近年研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcell,DC)是體內(nèi)高效抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentationcell,APC)，具有高效誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和增殖以及調(diào)節(jié)免疫耐受等能力。DC攝取抗原并活化后，其表面MHC-II、共刺激分子和各類(lèi)趨化因子表達(dá)水平增高，隨后通過(guò)其表面的MHC-抗原肽復(fù)合物與

2、T細(xì)胞表面受體相互結(jié)合，與共刺激分子共同作用，在特殊的細(xì)胞因子環(huán)境下誘導(dǎo)初始T細(xì)胞活化并向不同T細(xì)胞亞群分化、增殖。隨著研究的深入，越來(lái)越多的DC亞群被發(fā)現(xiàn)。然而，不同的DC亞群對(duì)各類(lèi)T細(xì)胞的活化、分化和增殖能力的影響不盡相同。因此調(diào)控DC的功能及表型有可能成為治療哮喘新的生物學(xué)靶點(diǎn)。已有部分實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)基因轉(zhuǎn)染、藥物干預(yù)等方法影響DC的表型和功能可以有效抑制哮喘的病理表現(xiàn)。但這些方法都存在著安全性和體內(nèi)可操作性等問(wèn)題。因此，對(duì)于如何安

3、全、有效地調(diào)節(jié)DC的表型和功能，恢復(fù)哮喘患者體內(nèi)各類(lèi)T細(xì)胞亞群的平衡值得我們深入研究。
　　BCG疫苗是結(jié)核分枝桿菌減毒疫苗，應(yīng)用范圍廣泛，其安全性和免疫穩(wěn)定性已得到肯定。流行病學(xué)證據(jù)表明兒童生長(zhǎng)早期接種BCG與其成年后發(fā)生過(guò)敏性疾病幾率呈負(fù)相關(guān)。在哮喘發(fā)病過(guò)程中，T細(xì)胞發(fā)揮核心功能，DC則處于始動(dòng)地位。多項(xiàng)研究證實(shí)BCG免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的發(fā)揮與其調(diào)控DC功能及亞型密切相關(guān)。小鼠經(jīng)BCG免疫后，其脾臟DC可有效抑制哮喘小鼠氣道炎癥。同

4、時(shí)，凍干BCG免疫小鼠后可以提高脾臟中類(lèi)漿細(xì)胞樣DC數(shù)量。由此看來(lái)，基于BCG的哮喘防治疫苗的構(gòu)建和開(kāi)發(fā)是可行的。由于屋塵螨是引發(fā)哮喘的重要過(guò)敏源，因此我們前期構(gòu)建了胞壁特異性表達(dá)屋塵螨抗原Derp2的重組BCG疫苗(Derp2rBCG)，并證實(shí)Derp2rBCG較BCG更有效抑制Derp2過(guò)敏性哮喘炎癥。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)Derp2rBCG較BCG以更為有效的方式調(diào)節(jié)體內(nèi)DC的功能和表型，改變Derp2特異性T細(xì)胞亞群分化與功

5、能，減弱或抑制哮喘病理改變。
　　Notch信號(hào)途徑是調(diào)控機(jī)體發(fā)育過(guò)程中的重要途徑，具有高度保守性。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，Notch信號(hào)共有四個(gè)受體(Notch1，2,3,4)和五個(gè)配體(Jagged-1,Jagged-2,Delta-like1,3,4)。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，Notch受體胞內(nèi)段(Notchintracellulardomain,NICD)轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合，解除RBP-J對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，同時(shí)募集

6、MAML1形成轉(zhuǎn)錄共激活物復(fù)合體，調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Notch通路受體和配體參與了DC與T細(xì)胞相互作用過(guò)程，不同受體和配體所產(chǎn)生的效應(yīng)是不同的。研究發(fā)現(xiàn)，DC表面Delta-like1,4(Dll1,Dll4)分子可促進(jìn)初始T細(xì)胞向Th1分化；而在促Th2分化的環(huán)境中，DC表面Jagged-2表達(dá)上調(diào)。Notch3誘導(dǎo)Th1分化，而Notch1、2與Th2分化相關(guān)。多篇文獻(xiàn)已報(bào)道分枝桿菌感染可影響Notch配體的表達(dá)水平。同時(shí)研

7、究人員發(fā)現(xiàn)，BCG進(jìn)入體內(nèi)后首先通過(guò)其表面病原相關(guān)分子模式（Pathogenrelatedmolecularprotein，PRMP）識(shí)別和結(jié)合DC表面的TLR9，經(jīng)MyD88依賴(lài)途徑影響DC胞內(nèi)Notch配體的表達(dá)，從而調(diào)控Th細(xì)胞分化發(fā)育。那么，Derp2rBCG的調(diào)節(jié)作用是否也通過(guò)調(diào)控DC胞內(nèi)的各類(lèi)Notch受體、配體表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)？值得我們關(guān)注。
　?、笮褪荏w酪氨酸激酶c-kit與其配體干細(xì)胞因子（SCF）表達(dá)于多種細(xì)胞表面，

8、具有廣泛的生物學(xué)功能，對(duì)免疫細(xì)胞的分化產(chǎn)生重要影響。經(jīng)外界過(guò)敏原刺激后，DC胞內(nèi)c-kit及其配體SCF表達(dá)水平上調(diào)進(jìn)而影響Th細(xì)胞分化。有研究表明，c-kit通過(guò)上調(diào)DC胞內(nèi)的IL-6以及jagged-2分子表達(dá)促進(jìn)Th2細(xì)胞分化。目前，關(guān)于BCG與c-kit及SCF相互作用關(guān)系的研究報(bào)道很少，因此，Derp2rBCG是否通過(guò)上述方式影響DC胞內(nèi)細(xì)胞因子水平改變進(jìn)而調(diào)節(jié)jagged-2表達(dá)，最終影響Th細(xì)胞分化值得我們進(jìn)一步研究。

9、r>　　我們前期研究已顯示，Derp2rBCG可有效下調(diào)哮喘小鼠氣道炎癥，其作用機(jī)制既涉及調(diào)節(jié)哮喘Th免疫偏倚，又包括誘導(dǎo)體內(nèi)CD4+CD25+Treg的產(chǎn)生，引起免疫耐受。但對(duì)于Derp2rBCG如何產(chǎn)生上述免疫調(diào)控的機(jī)制尚待研究。鑒于DC在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的特殊地位，我們以此為著眼點(diǎn)探索Derp2rBCG對(duì)DC表型和功能影響及可能的機(jī)制，并觀察其對(duì)各類(lèi)Th細(xì)胞亞群分化的調(diào)控及對(duì)哮喘病理和病理生理的影響，為臨床哮喘疫苗的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)

10、。
　　本課題主要研究結(jié)果
　　1.Derp2rBCG對(duì)小鼠不同來(lái)源DC表型及功能有部分調(diào)控作用
　　首先，原代培養(yǎng)小鼠骨髓、脾臟和肺臟來(lái)源DC，并經(jīng)Derp2rBCG刺激72h。FACS分析結(jié)果顯示：Derp2rBCG體外刺激可有效提高各組DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表達(dá)，有效活化DC，其活化能力與BCG無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。收集各組DC細(xì)胞培養(yǎng)液上清，ELISA檢測(cè)其中細(xì)胞因子水平改變，結(jié)果顯示：De

11、rp2rBCG和BCG均可提高IL-12水平，但前者較BCG更明顯提高不同來(lái)源DC分泌TGF-β和IL-10水平。此外，BCG上調(diào)IL-6水平，而Derp2rBCG促進(jìn)三種DC分泌IL-6能力較BCG弱；隨后利用Derp2rBCG免疫小鼠42天后，分離骨髓、脾臟、肺臟淋巴結(jié)DC，F(xiàn)ACS檢測(cè)各組DC表面分子（CD80/CD86/MHCII）改變。結(jié)果顯示：Derp2rBCG可有效活化脾臟DC和肺臟DC，其活化能力與BCG一致，但對(duì)骨髓源

12、性DC影響不明顯。將分離的脾臟，肺臟淋巴結(jié)DC培養(yǎng)6d后，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中各類(lèi)細(xì)胞因子含量：IL-12，TGF-β，IL-10趨勢(shì)與體外結(jié)果相似；BCG免疫組脾臟DC培養(yǎng)上清中IL-6含量較高（p＜0.05），但肺引流淋巴結(jié)DC上清中IL-6含量則無(wú)明顯變化（p＞0.05）；Derp2rBCG免疫組的脾臟DC和肺臟淋巴結(jié)DC上清中IL-6含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。另外，我們發(fā)現(xiàn)Derp2rBCG體內(nèi)免疫后可明顯提高小鼠腹腔引流

13、淋巴結(jié)pDC的細(xì)胞比例及絕對(duì)數(shù)，而B(niǎo)CG則無(wú)此作用。
　　2.Derp2rBCG調(diào)節(jié)DC誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向不同Th亞群分化。
　　我們首先利用CD4+CD62L+免疫磁珠試劑盒從正常小鼠脾臟分離CD4+CD62LhiT(Th0)細(xì)胞，分選效率達(dá)85％以上，將Th0細(xì)胞與經(jīng)PS/BCG/Derp2rBCG刺激的DC，按5：1比例共培養(yǎng)，經(jīng)Derp2抗原刺激72h，隨后收集T細(xì)胞，經(jīng)FACS檢測(cè)Th0細(xì)胞向各個(gè)亞群分化比率。結(jié)果顯

14、示：與PS比較，Derp2rBCG和BCG具有更強(qiáng)誘導(dǎo)Th1亞群分化和抑制Th2亞群分化的功能。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)BCG可誘導(dǎo)體外Th17細(xì)胞分化，但Derp2rBCG則無(wú)此作用。值得注意的是，Derp2rBCG比BCG組具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞產(chǎn)生的能力。體內(nèi)試驗(yàn)中，我們將PS/BCG/Derp2rBCG免疫小鼠42天后制備哮喘模型，分離肺臟引流淋巴結(jié)，用尼龍膜過(guò)濾制成單細(xì)胞懸液，F(xiàn)ACS分析結(jié)果顯示：Derp2

15、rBCG和BCG均可抑制哮喘小鼠Th2細(xì)胞過(guò)度分化，上調(diào)Th1細(xì)胞；前者明顯減少Th17比例，而后者則促進(jìn)Th17的產(chǎn)生；前者顯著提高CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比率，而后者的影響并不明顯。
　　3.Derp2rBCG調(diào)節(jié)DC功能的分子機(jī)制
　　以上2部分實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了Derp2rBCG具有通過(guò)調(diào)控DC功能及表型從而影響Th0細(xì)胞向各個(gè)不同Th細(xì)胞亞群分化的能力。隨后，我們初步研究了參與這種調(diào)控的分子信號(hào)通路。我們利

16、用Real-timePCR和Westernblot方法檢測(cè)到Derp2rBCG與BCG均能顯著上調(diào)DC內(nèi)Dll-4的表達(dá)水平，但對(duì)Dll-1、3表達(dá)均無(wú)明顯影響。Derp2rBCG可下調(diào)DC內(nèi)Jagged-2表達(dá)，其作用能力較BCG更強(qiáng)。OxPAPC可阻斷Derp2rBCG的上述作用。Derp2rBCG刺激DC內(nèi)c-kit表達(dá)的能力較BCG低。
　　4.Derp2rBCG-DC在哮喘小鼠模型中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用
　　為進(jìn)一步證

17、實(shí)經(jīng)Derp2rBCG調(diào)控的DC在體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)能力，我們進(jìn)行了體內(nèi)DC移植實(shí)驗(yàn)。首先分離出經(jīng)PS/BCG/Derp2rBCG免疫后的小鼠腹腔淋巴結(jié)DC，將其移植入Derp2抗原致敏的小鼠體內(nèi)，再經(jīng)抗原激發(fā)構(gòu)建哮喘小鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分6組：正常小鼠組、哮喘模型組、Derp2rBCG-DC移植組、BCG-DC移植組、PS-DC移植組和Derp2rBCG-DC移植+PC61組。經(jīng)HE，AB-PAS染色法觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變，結(jié)果顯示：

18、Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺組織炎癥較哮喘模型組明顯減輕，氣道粘液分泌減少；Derp2rBCG-DC可降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性；ELISA結(jié)果提示：Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺泡灌洗液中Th1細(xì)胞因子上調(diào)，Th2細(xì)胞因子下調(diào)，調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子TGF-β,IL-10水平增高；FACS結(jié)果顯示Derp2rBCG-DC移植組小鼠肺臟引流淋巴結(jié)中Th1，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比例及絕對(duì)數(shù)上升，而Th2細(xì)胞亞群比

19、例及絕對(duì)數(shù)下降；值得注意的是，使用Treg清除劑PC61可有效逆轉(zhuǎn)該現(xiàn)象。
　　結(jié)論
　　1）Derp2rBCG與BCG一樣可上調(diào)DC表面MHC-II、共刺激因子CD80和CD86表達(dá)水平，有效活化DC。此外，Derp2rBCG體內(nèi)免疫還可以提高小鼠腹腔引流淋巴結(jié)中pDC的比例與細(xì)胞絕對(duì)數(shù)；
　　2）Derp2rBCG對(duì)DC誘導(dǎo)Th0向各個(gè)Th細(xì)胞亞群分化產(chǎn)生重要影響。Derp2rBCG與BCG相似，均能刺激不同來(lái)源D

20、C釋放Th1細(xì)胞因子，但前者能更有效地刺激DC分泌調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子TGF-β，IL-10，從而具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞分化的能力。Derp2rBCG促DC分泌IL-6能力較BCG弱；
　　3）Derp2rBCG通過(guò)TLR途徑調(diào)控DC內(nèi)Notch配體表達(dá)，進(jìn)而影響Th1/Th2細(xì)胞亞群比例；
　　4）Derp2rBCG促進(jìn)DC內(nèi)c-kit表達(dá)能力較BCG低，因此產(chǎn)生較少的IL-6，從而誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分