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文檔簡介
1、哮喘是一種以可逆性氣道阻塞、嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特征的慢性氣道疾病??乖禺愋訡D4+Th2細(xì)胞產(chǎn)生的大量IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子直接導(dǎo)致了哮喘的各種病理生理改變。此外,哮喘的發(fā)病與環(huán)境變應(yīng)原誘導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)直接相關(guān)。其中,屋塵螨抗原是最重要的誘發(fā)哮喘的室內(nèi)變應(yīng)原。
構(gòu)建變應(yīng)原重組免疫調(diào)節(jié)疫苗,轉(zhuǎn)變有害的變應(yīng)性Th2免疫應(yīng)答為保護(hù)性免疫應(yīng)答、進(jìn)而改變哮喘疾病進(jìn)程、從而獲得滿意長期
2、療效的治療策略是哮喘基礎(chǔ)和臨床研究的一個(gè)重要方向。我們課題組前期構(gòu)建了胞壁表達(dá)屋塵螨抗原Derp2的重組BCG疫苗(Derp2recombinedBCG)。隨后的研究證實(shí),該rBCG可誘導(dǎo)naive小鼠發(fā)生Th2向Th1方向的免疫偏移。但是,Derp2rBCG在小鼠哮喘模型中的免疫調(diào)節(jié)作用仍不清楚。
BCG是廣泛應(yīng)用的Th1應(yīng)答誘導(dǎo)疫苗。幾項(xiàng)研究表明BCG可通過誘導(dǎo)Th2向Th1方向的免疫偏移治療哮喘等變應(yīng)性疾病。但是近年來有
3、研究認(rèn)為分枝桿菌下調(diào)哮喘氣道炎癥與其作為免疫佐劑誘導(dǎo)生成Tregs有關(guān),而與免疫偏移無關(guān)。因此,BCG/rBCG抑制哮喘氣道炎癥的免疫學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。
Notch是一條高度保守的調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的信號通路。Notch配體和受體之間的相互作用可以觸發(fā)受體釋放胞內(nèi)段NIC進(jìn)入胞漿。NIC轉(zhuǎn)位至核內(nèi)并與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合。RBP-J進(jìn)一步調(diào)控Hes家族分子等下游基因的表達(dá)。Hes蛋白是抑制性bHLH分子,可抑制許多bH
4、LH家族分子的表達(dá)。
Notch信號調(diào)控著T細(xì)胞發(fā)育多個(gè)階段的譜系決定過程。有研究提示Notch信號參與了Tregs的分化過程。但是Notch信號在nTregs的發(fā)育和功能維持中具體作用仍不清楚。Foxp3是調(diào)控nTregs發(fā)育和功能的關(guān)鍵分子。Notch信號是否可以直接調(diào)控Foxp3的表達(dá)及其機(jī)制如何仍不清楚。
本研究的目的是:(1)觀察Derp2rBCG對哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用并探討其免疫學(xué)機(jī)制;(2)觀察N
5、otch信號對Foxp3表達(dá)的調(diào)控作用并闡明其調(diào)控機(jī)制。其主要研究成果如下:
1.證實(shí)了在OVA及Derp2兩種變應(yīng)原誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中,Derp2rBCG免疫可以下調(diào)氣道局部的炎癥細(xì)胞浸潤,肺組織病理形態(tài)學(xué)改變,粘液高分泌及肥大細(xì)胞脫顆?,F(xiàn)象。對BALF中Th2類細(xì)胞因子表達(dá)譜的檢測分析表明Derp2rBCG減少了IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生。所以,Derp2rBCG可以有效下調(diào)哮喘變應(yīng)性Th2免疫應(yīng)答。
6、 2.通過對哮喘小鼠BALF中IFN-γ/IL-4及肺組織中IFN-γ/IL-4mRNA的分析,發(fā)現(xiàn)Derp2rBCG免疫可誘導(dǎo)哮喘小鼠發(fā)生Th2向Th1方向的免疫偏移,改變氣道局部及全肺組織中的Th2細(xì)胞因子極化環(huán)境。
3.發(fā)現(xiàn)Derp2rBCG上調(diào)了Derp2誘導(dǎo)的哮喘小鼠BALF中TGF-β的水平;Derp2rBCG免疫增加了小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的相對比例和絕對數(shù)量;Derp2rBCG誘導(dǎo)產(chǎn)生的
7、CD4+CD25+T細(xì)胞可以在體外以抗原特異性的方式抑制效應(yīng)CD4+T細(xì)胞的增殖;過繼轉(zhuǎn)移Derp2rBCG誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞可定向遷移至受體哮喘小鼠胸腔局部引流淋巴結(jié)下調(diào)氣道局部炎癥。因此,Derp2rBCG對哮喘氣道炎癥的下調(diào)作用也與其誘導(dǎo)的Tregs介導(dǎo)的免疫抑制有關(guān)。
4.通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在小鼠和人FOXP3啟動子中均存在假定的RBP-J結(jié)合位點(diǎn)和Hes結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步通過報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了異位過
8、表達(dá)NIC可以增強(qiáng)FOXP3啟動子活性。DNApull-down實(shí)驗(yàn)表明NIC-RBP-J復(fù)合物可以與FOXP3啟動子中的RBP-J結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。GSI阻斷Notch信號后CD4+CD25+Tregs中Foxp3的表達(dá)下調(diào)。因此,Notch信號可以直接調(diào)控Foxp3的表達(dá)。但ChIP分析表明在CD4+CD25-T細(xì)胞中NIC-RBP-J復(fù)合物也與FOXP3啟動子結(jié)合在一起,提示Notch信號并沒有參與Tregs發(fā)育的譜系形成過程。
9、> 5.構(gòu)建了一系列RBP-J結(jié)合位點(diǎn)和N-box位點(diǎn)的截短及點(diǎn)突變的報(bào)告基因質(zhì)粒。通過報(bào)告基因發(fā)現(xiàn),NIC-RBP-J復(fù)合物是FOXP3啟動子的反式激活因子,而Hes1是反式阻遏因子。Westernblot證實(shí)在高劑量NIC下調(diào)FOXP3啟動子活性時(shí),Hes1被誘導(dǎo)表達(dá)。因此,Notch信號以雙相性的方式調(diào)節(jié)FOXP3啟動子的活性:低水平的Notch信號通過NIC-RBP-J復(fù)合物增強(qiáng)FOXP3啟動子活性,而高水平的Notch信號通
10、過Hes1下調(diào)了FOXP3啟動子活性。
6.通過ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hes1僅在CD4+CD25-T細(xì)胞中與FOXP3啟動子結(jié)合,在Tregs中anti-Hes1并不能沉淀出FOXP3啟動子中的相應(yīng)染色質(zhì)片斷。同時(shí),點(diǎn)突變報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明Hes1對FOXP3啟動子活性有顯著的抑制作用。所以Hes1可能是Tregs發(fā)育的譜系決定過程中轉(zhuǎn)錄因子水平的一個(gè)重要調(diào)控因子。
綜上所述,我們證實(shí)了自行構(gòu)建的Derp2rBCG可以有效
11、下調(diào)哮喘變應(yīng)性Th2免疫應(yīng)答,其介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)過程同時(shí)涉及了免疫抑制和免疫偏移兩種機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)提供了又一個(gè)可行的哮喘免疫調(diào)節(jié)治療方法,并在一定程度上豐富了哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。我們還發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可以通過RBP-J和Hes1依賴的機(jī)制雙相性的直接調(diào)控FOXP3啟動子活性,Hes1可能是Tregs發(fā)育的譜系決定過程中轉(zhuǎn)錄因子水平的一個(gè)重要調(diào)控因子。這部分研究結(jié)果為nTregs的發(fā)育分化機(jī)制研究提供了一條新的重要線索,并在一定程度上
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