IKBKE在人星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其抗星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的分子機制.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的惡性腫瘤，由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長且與周圍腦組織邊界不清，運用現(xiàn)代顯微外科技術(shù)、放療、化療等綜合治療措施后膠質(zhì)瘤患者預(yù)后依然不理想。闡述膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制，尋找特異性診斷和治療靶標(biāo)是目前膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)研究的重點。
　　 原癌基因的激活和抑癌基因的失活可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，尤其是許多激酶類的原癌基因的激活因為在人類腫瘤中起著必需的作用而引起廣泛關(guān)注。IKBKE和ILK均屬于絲氨酸/蘇氨

2、酸激酶家族的一員，其功能和作用機制尚未完全不清楚。目前尚未有IKBKE和ILK在星形細(xì)胞瘤方面的研究報道。
　　 第一部分、IKBKE和ILK在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)
　　 方法：1)采用Real time RT-PCR、western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測IKBKE和ILK在正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞及人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。2)收集4對臨床星形細(xì)胞瘤及腫瘤周邊正常腦組織，提取總蛋白和mRNA，采用Realtim

3、e RT-PCR和western blot方法檢測IKBKE和ILK的表達(dá)。3)對71例臨床星形細(xì)胞瘤和10例正常人腦組織石蠟標(biāo)本行SP免疫組織化學(xué)染色，檢測IKBKE蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS10.0進行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析(P<0.01)。4)對228例臨床星形細(xì)胞瘤和10例正常人腦組織石蠟標(biāo)本行SP免疫組織化學(xué)染色，檢測ILK蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS10.0進行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析(P<0.01)。
　　 結(jié)果：1)人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞

4、系中IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表達(dá)，而在正常人星形細(xì)胞中IKBKE和ILK mRNA和蛋白低表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示IKBKE在正常人星形細(xì)胞中無明顯表達(dá)，在星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系中呈強陽性表達(dá)。2)人星形細(xì)胞瘤組織IKBKE和ILK mRNA和蛋白高表達(dá)，而在其對應(yīng)的瘤旁組織中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表達(dá)。3)免疫組化結(jié)果表明在星形細(xì)胞瘤組織中IKBKE定位于細(xì)胞漿，IKBKE在星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)并在正常腦組織中低表達(dá)

5、或不表達(dá)，星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中平均光密度值明顯高于正常腦組織標(biāo)本(p<0.01)；Spearman相關(guān)性分析顯示IKBKE的高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤的病理分級無顯著性相關(guān)。4)免疫組化結(jié)果表明ILK在星形細(xì)胞瘤組織中高表達(dá)并在正常腦組織中低表達(dá)，ILK高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤的病理分級正相關(guān)，隨著ILK表達(dá)的增強，總體生存曲線有逐漸下降的趨勢。
　　 結(jié)論：
　　 1.正常人星形細(xì)胞中IKBKE和ILKmRNA和蛋白低表達(dá)，人星形細(xì)胞瘤

6、細(xì)胞系中IKBKE的mRNA和蛋白均有不同程度的高表達(dá)；
　　 2.人星形細(xì)胞瘤組織中IKBKE和ILK mRNA和蛋白表達(dá)水平均比瘤旁組織升高；
　　 3.IKBKE蛋白在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，不同級別的星形細(xì)胞瘤IKBKE表達(dá)均顯著高于正常腦組織。IKBKE高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤臨床分級二者之間無顯著性相關(guān)。
　　 4.ILK蛋白在正常腦組織中低表達(dá)或不表達(dá)，不同級別的星形細(xì)胞瘤ILK表達(dá)均顯著高于正常腦組

7、織。ILK高表達(dá)與星形細(xì)胞瘤臨床分級二者之間呈顯著性正相關(guān)，與患者的生存率負(fù)相關(guān)。
　　 第二部分、IKBKE異常表達(dá)對星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響
　　 正常細(xì)胞的增殖、分化、凋亡受到一序列復(fù)雜基因群的嚴(yán)格調(diào)控，膠質(zhì)瘤療效不佳主要與下列因素有關(guān)：細(xì)胞增殖失控、細(xì)胞抵抗凋亡、豐富的血管生成等，其中細(xì)胞增殖/凋亡的失衡可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生和難治的重要機制。研究表明抑制宮頸癌Hela細(xì)胞和有IKBKE擴增的乳腺癌細(xì)胞系IKBKE的表

8、達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本部分旨在探討IKBKE表達(dá)上調(diào)和下調(diào)后對星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：1)采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法將pBabe-Puro-Flag和pBabe-Puro-Flag-IKBKE分別轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代，收集和抽提第5代細(xì)胞的總RNA和蛋白，經(jīng)定量Real time RT-PCR和Western Blot檢測IKBKE的表達(dá)。2)構(gòu)建3種pSUPER.r

9、etro.puro/IKBKERNAi，繼采用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法將3種pSUPER.retro.puro/IKBKE RNAi和pSUPER.retro.puro分別轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18，經(jīng)嘌呤霉素篩選，連續(xù)傳代，收集和抽提第5代細(xì)胞的總mRNA和蛋白，real timeRT-PCR和western blot檢測IKBKE的表達(dá)。3)adriamycin(0.1μM)誘導(dǎo)后Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)

10、記法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的凋亡；UV(40J/m2)誘導(dǎo)后TUNEL法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的凋亡；不同劑量的UV和不同濃度的adriamycin處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，通過活細(xì)胞計數(shù)、檢測Bcl-2和caspase-3變化以確定IKBKE對星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：1) U87MG/pBabe-Puro-Flag-IKBKE和LN-18/pBabe-Puro-Flag-IKBKE細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均明顯

11、高于對照組細(xì)胞U87MG和LN-18空載體。2)U87MG/pSUPER.retro.puro/RNAi和LN-18/pSUPER。retro.puro/RNAi細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均低于空載體對照組，其中LN-18/pSUPER.retro.puro[RNAil和LN-18/pSUPER.retro.puro/RNAi3細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量下降更明顯，U87MG/pSUPER.retro. puro/RNAi3

12、細(xì)胞中IKBKE的表達(dá)量下降更明顯，隨后的現(xiàn)象和作用機制的研究以這些穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系為研究對象。3)LN-18和U87MG/pBabe- Puro-Flag-IKBKE星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系與空載體Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記和TUNEL法結(jié)果對比顯示，后者細(xì)胞凋亡比例較高。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立外源性IKBKE高表達(dá)的人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18pBabe-Puro-Flag-IKBKE。<

13、br>　　 2.成功構(gòu)建了IKBKE RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87MG和LN-18pSUPER.retro.puro/RNAi。
　　 3.IKBKE表達(dá)上調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系抗凋亡能力增強，IKBKE表達(dá)下調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系抗凋亡能力減弱。
　　 4.IKBKE表達(dá)下調(diào)后U87MG和LN-18穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系激活的Caspase-3增多，Bcl-2減少，細(xì)胞凋亡增多

14、；IKBKE表達(dá)上調(diào)后激活的Caspase-3減少，Bcl-2增多，細(xì)胞凋亡減少。
　　 第三部分、IKBKE異常表達(dá)對星形細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡影響作用機制的研究
　　 IKK(IkB kinase)家族屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，可以磷酸化IkB，從而激活NF-kB通路，促進NF-kB核移位。那么IKBKE作為IKK家族成員之一，其在星形細(xì)胞瘤中是否可以通過激活NF-kB通路的發(fā)揮抗凋亡作用？不同IKK家族成員可以作用于不同Ik

15、B家族成員，而后者決定了NF-kB激活后哪個/些家族成員發(fā)生核移位。IKBKE是否可以促進某個NF-kB家族成員發(fā)生核移位亦是本部分將探討的內(nèi)容。
　　 方法：1)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染NF-kB報告基因質(zhì)粒和pRL-TK，24h后檢測螢火蟲熒光素酶活性，所有的熒光素酶活性用Rellina活性正態(tài)化得到相對熒光素值，從而了解NF-kB啟動子的活性。2)在IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染NF-k

16、B報告基因質(zhì)粒和突變型IKBα質(zhì)粒，檢測螢火蟲熒光素酶活性，所有的熒光素酶活性用Rellina活性正態(tài)化得到相對熒光素值，從而了解NF-kB啟動子的活性。3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系NF-kB家族成員之一--p50免疫熒光染色，觀察p50在細(xì)胞核和細(xì)胞漿的分布。4)提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白后用western blot法檢測p50的定位。
　　 結(jié)果：1)在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染NF-kB報告基因質(zhì)粒后顯示IKBK

17、E表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞系內(nèi)蛋白裂解物的相對熒光素值明顯高于其空載體對照組，IKBKE表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞內(nèi)蛋白裂解物的相對熒光素值顯著低于其空載體對照組。2)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染NF-kB報告基因質(zhì)粒和突變型IKBα基因質(zhì)粒后顯示IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系相對熒光素值顯著低于其空載體對照組。3)空載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核和細(xì)胞漿均可見p50熒光染色，IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50熒光染色明顯增強，細(xì)胞漿p50熒光染色減弱，IKBK

18、E表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50熒光染色顯著減弱。4)IKBKE表達(dá)上調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50蛋白增多，細(xì)胞漿p50蛋白減少，IKBKE表達(dá)下調(diào)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系細(xì)胞核p50蛋白減少，細(xì)胞漿p50蛋白增多。
　　 結(jié)論：
　　 1.人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中IKBKE可通過磷酸化Ikα激活NF-kB通路。
　　 2.IKBKE可促進NF-kB家族成員p50發(fā)生核移位，作用于其靶基因(如Bcl-2)從而發(fā)揮其抗星