肝病大鼠創(chuàng)傷弧菌攻擊后血清細(xì)胞因子變化與多器官損傷實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus，Vv)攻擊肝病大鼠后血清前炎癥因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、炎癥拮抗因子(IL-10)的變化以及SOD活性、NO含量變化與心、肝、肺和腎等重要器官超微結(jié)構(gòu)改變的實(shí)驗(yàn)研究，并與前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)免疫干預(yù)組相比較，為Vv感染所致多器官功能障礙綜合征的預(yù)防和臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：肝病大鼠組和肝病大鼠PGE2預(yù)注射組經(jīng)Vv攻擊

2、后血清細(xì)胞因子、相關(guān)酶類檢測(cè)以及心、肝、肺和腎超微結(jié)構(gòu)改變觀察，并與正常大鼠相對(duì)照。 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組120只清潔級(jí)大鼠(醫(yī)動(dòng)字第20030002)，160．180g／只，雌雄各半，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物分組采用單純隨機(jī)抽樣法。 1．1 試驗(yàn)組：取60只大鼠用10％的四氯化碳橄欖油溶液皮下注射，連續(xù)12周，制作慢性肝病大鼠模型。取其中一只在電鏡下證實(shí)己形成慢性肝病后隨機(jī)取36只分4組(n=9)： ①

3、肝病大鼠Vv攻擊組； ②肝病大鼠Vv攻擊后氧氟沙星等治療組； ③肝病大鼠Vv攻擊后PGE2與氧氟沙星等聯(lián)合保護(hù)組； ④肝病大鼠陰性組。 1．2 對(duì)照組：隨機(jī)取36只分4組(n--9)： ①正常大鼠Vv攻擊組； ②正常大鼠Vv攻擊后氧氟沙星等治療組； ③正常大鼠Vv攻擊后PGE2與氧氟沙星等聯(lián)合保護(hù)組； ④正常大鼠陰性組。 2 實(shí)驗(yàn)與方法 2．1 Vv攻擊試驗(yàn)

4、及藥物保護(hù)：試驗(yàn)①②組和對(duì)照①②組均腹腔注射Vv菌液0．4ml／只(1．25×107cfu／m1)；②組再肌肉注射氧氟沙星、異丙嗪和潑尼松尼藥液0．4ml／只；③組肌肉預(yù)注射0．2mlPGE2溶液2h后，腹腔注射等量Vv菌液，再1h后肌肉注射等劑量氧氟沙星等藥物；④組腹腔注射0．9％NS0．4ml／只。 2．2 腹腔液培養(yǎng)：各組取腹腔液接種Vv培養(yǎng)基(堿性)，同時(shí)接種血平板(證實(shí)無(wú)其他細(xì)菌生長(zhǎng))，37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

5、2．3 死亡率比較：觀察各組24h存活數(shù)，比較生存率差異。 2．4 細(xì)胞因子比較：各組心臟無(wú)菌采血分離血清，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-6，比較組間差異。 2．5 SOD活性和NO濃度比較：采用分光光度法檢測(cè)血清SOD、NO，比較組間差異。 2．6 心、肝、肺、。腎超微結(jié)構(gòu)觀察：快速取大鼠心、肝、肺、腎標(biāo)本經(jīng)2．5％戊二醛預(yù)固定，環(huán)氧樹脂包埋、切片、鈾．鉛雙重染色后電鏡下

6、觀察超微結(jié)構(gòu)。 2．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Spssl0．0軟件對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，組間LSD(Least-significantdifference)檢驗(yàn)，對(duì)生存率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1 24h內(nèi)大鼠存活情況：肝病Vv攻擊組6h死亡4只，12h全部死亡；正常Vv攻擊組6h全部存活，12h死亡2只，24h死亡4只；正常陰性組、肝病陰性組大鼠24h全部存活，比較其24h存活率，P=0．042，統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯

7、著。 2 分離培養(yǎng)：所有存活大鼠的腹腔液37℃過(guò)夜培養(yǎng)均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，而肝病Vv攻擊組以及正常Vv攻擊組死亡大鼠腹腔液過(guò)夜培養(yǎng)均檢出Vv。 3 細(xì)胞因子比較：大鼠Vv攻擊后細(xì)胞因子平衡失調(diào)，無(wú)論是肝病Vv攻擊組還是正常Vv攻擊組，與陰性組相比較TNF-a、IL．1β、IL-6均顯著升高，同時(shí)IL．10明顯下降(為P<0．01)。肝病陰性組與正常陰性組相比，IL一10、TNF-o[、IL一1p、IL-6明顯降低，其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、顯著(P

9、型上皮細(xì)胞的脫落、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞破壞、核固縮：而正常Vv攻擊組器官超微結(jié)構(gòu)病變較輕。 6 PGE2免疫干預(yù)作用：(1)細(xì)胞因子比較：與肝病大鼠Vv攻擊組及肝病大鼠Vv攻擊后氧氟沙星等治療組比，PGE2免疫干預(yù)組TNF-ct、IL—lB、IL-6明顯降低，IL一10顯著升高。(2)NO、SOD比較：與肝病大鼠Vv攻擊組及肝病大鼠Vv攻擊后氧氟沙星等治療組比，PGE2免疫干預(yù)組NO濃度明顯降低(P<0．、01)，SOD

10、顯著升高(P<0．05)。(3)心、肝、肺、腎超微結(jié)構(gòu)比較：PGE2免疫干預(yù)組器官超微結(jié)構(gòu)明顯改善，表現(xiàn)為無(wú)肌膜下水腫、未見(jiàn)肌絲溶解斷裂；肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常；肺泡間隔以及毛細(xì)支氣管未見(jiàn)結(jié)構(gòu)病變；腎小球細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完好。 結(jié)論： 1 Vv攻擊后炎癥過(guò)程中TNF-ct、IL一1p和IL-6等前炎癥因子的過(guò)度釋放、大量NO的細(xì)胞毒作用以及02’‘清除障礙是導(dǎo)致多器官損害的重要原因。 2 肝病大鼠前炎癥因子T