阿奇霉素對(duì)實(shí)驗(yàn)性酒精性肝病大鼠細(xì)胞因子和血清NO的影響.pdf

1、由于長期大量飲酒，酒精及其代謝物乙醛等直接或通過免疫機(jī)制間接損害肝細(xì)胞，發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變性、酒精性肝炎、肝纖維化、肝硬化。酒精性肝纖維化是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分泌和降解失平衡所致，是一個(gè)慢性、可逆的過程，它既是酒精性脂肪肝(AF)、肝炎(AH)的結(jié)果又是肝癌或肝硬化的病理基礎(chǔ)，也是研究酒精性肝病進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)的中心環(huán)節(jié)。目前發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子在酒精性肝纖維化的發(fā)生中起重要作用。而結(jié)締組織生長因子(CTGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和血清一

2、氧化氮(NO)在酒精性肝病中聯(lián)合研究的報(bào)道并不多見。 該研究利用已經(jīng)建立的酒精定量灌胃的動(dòng)物模型，觀察不同時(shí)期(4、8、12周)大鼠肝臟的病理、纖維化程度與CTGF、TNF-α定位和血清NO動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)也觀察了阿奇霉素對(duì)其表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討酒精性肝病的作用機(jī)制、預(yù)防和臨床治療提供幫助。 實(shí)驗(yàn)材料 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠96只，正常組25只，酒精組38只，治療組33只。 二、主要試劑及藥

3、品 ①無水乙醇；②兔抗大鼠結(jié)締組織生長因子(1：100)，兔抗大鼠腫瘤壞死因子(1：100)，鏈酶抗生物素-生物素(SABC)試劑盒及3，3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑；③一氧化氮試劑盒；④阿奇霉素。 三、主要儀器 ①石蠟切片機(jī)；②光學(xué)顯微鏡及照相裝置；③顯微(熒光)圖像分析系統(tǒng)。 實(shí)驗(yàn)方法 一、動(dòng)物模型96只大鼠隨機(jī)分為3組：正常組25只，酒精組38只，治療(阿奇霉素加酒精)組33只。酒精組給予40％乙醇(

4、8g·kg-1·day-1)，分三次灌胃至4周末；自第5周開始，將乙醇濃度增至50％(9g·kg-1·day-1)，分三次灌胃至8周末；自第9周開始，50％乙醇(10g·kg-1·day-1)分三次灌胃至12周末。治療組在4、8、12周酒精灌胃基礎(chǔ)上前5天連續(xù)給予阿奇霉素(10mg·kg-1·day-1)。正常組動(dòng)物給予相同容積的生理鹽水，日三次灌胃。于開始灌胃4周末、8周末、12周末分別處死酒精組12、16、10只，治療組10、14、

5、9只及正常組動(dòng)物9、8、8只。 二、病理學(xué)檢查取肝組織右葉中部兩小塊，用中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4μm的連續(xù)切片，做HE染色后，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變及纖維化程度，并對(duì)肝細(xì)胞壞死、炎細(xì)胞浸潤進(jìn)行半定量分析：壞死按壞死灶數(shù)/mm2計(jì)算；炎細(xì)胞浸潤按炎細(xì)胞個(gè)數(shù)/mm2計(jì)算。每張切片測量至少選取5個(gè)視野，包括中央和四周。 三、免疫組化ABC法檢測結(jié)締組織生長因子(CTGF)、腫瘤壞死因子(TNF-α)石蠟脫蠟至水，滅

6、活內(nèi)源性酶，微波修復(fù)，加正常兔血清，加一抗CTGF、TNF-α(1：100)4℃過夜，滴加二抗37℃孵育30分鐘，ABC復(fù)合物37℃孵育30分鐘，以上各步均以0.01M的PBS充分洗滌。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，顯微鏡下觀察。以細(xì)胞漿中有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。應(yīng)用顯微(熒光)圖像分析系統(tǒng)對(duì)選取視野內(nèi)CTGF、TNF-α免疫組化陽性信號(hào)進(jìn)行分析。 四、血清一氧化氮(NO)的測定從大鼠心尖部采集血液2ml，室溫下靜止30分鐘

7、，2000rpm/min離心10分鐘，收集上清液，-20℃保存。采用硝酸還原酶法，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。試劑盒說明：血清NO正常參考值為65.7±15.8μmol/L。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，各組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、一般情況酒精組大鼠同正常組相比，一般狀態(tài)差，毛色無光澤，易激惹，體重減輕(P＜0.01)；治療

8、組大鼠似正常組(P＞0.05)，治療組與酒精組體重相比差異顯著(P＜0.01)。 二、肝臟組織病理學(xué)檢查HE染色標(biāo)本光鏡下，正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心向外周呈放射狀分布；酒精灌胃4W末，局限性肝小葉中央靜脈區(qū)脂肪變性及空泡變性小于1/3，肝細(xì)胞點(diǎn)片狀壞死，炎細(xì)胞浸潤；8W末，肝小葉中央靜脈區(qū)脂肪變性及空泡變性明顯增多且小于2/3，肝細(xì)胞呈大片狀壞死；12W末，大于2/3肝小葉形成彌漫性以大空泡變性為主的混合性脂肪變，肝細(xì)胞壞死

9、增多。 三、CTGF、TNF-α在肝臟的表達(dá)酒精組、治療組與正常組相比，肝臟CTGF、TNF-α的表達(dá)均增加，具有顯著性差異(P＜0.01)，酒精組與治療組相比亦有顯著差異(P＜0.05)；隨著乙醇刺激時(shí)間的延長和劑量的不斷加大，各酒精組及治療組之間肝臟CTGF、TNF-α的表達(dá)也逐漸增加(P＜0.01)。 討論 在我國近年來酒精性肝病(ALD)的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，在一些地區(qū)成為第二肝病。目前國內(nèi)對(duì)其發(fā)病機(jī)

10、制研究較少，起步較晚，主要由于酒精性肝病的動(dòng)物模型較難制備和在人體研究的限制。應(yīng)用自由飲用(酒精)法建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，所用時(shí)間長，而且受干擾因素也較多。該研究在反復(fù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用酒精直接灌胃逐漸增加乙醇含量及濃度，成功地制備了酒精性肝病動(dòng)物模型，進(jìn)行了有關(guān)發(fā)病機(jī)制和治療的初步研究。 長期慢性大量酒精攝入可導(dǎo)致腸源性高內(nèi)毒素血癥，曾有人統(tǒng)計(jì)ALD中內(nèi)毒素升高者占67.3％。內(nèi)毒素(ET)是一種革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁中的脂多糖(L

11、PS)，在正常情況下，少量內(nèi)毒素可通過腸壁滲透進(jìn)入肝臟。有證據(jù)表明酒精可改變腸道菌叢及PH值引起G-細(xì)菌過度繁殖，另外酒精可使腸壁對(duì)內(nèi)毒素的滲透增加，降低Kupffer’s細(xì)胞的吞噬能力，使嗜酒者血液內(nèi)毒素水平升高從而導(dǎo)致高內(nèi)毒素血癥。高水平LPS激活肝星狀細(xì)胞(HSC)、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)型NO合酶(iNOS)活化可引起NO大量合成，同時(shí)激活枯否細(xì)胞釋放炎癥介導(dǎo)物(如TNF-α)等導(dǎo)致肝損害。 NO與TNF-α協(xié)同

12、作用可使靜止肝星狀細(xì)胞(HepaticStellateCell，HSC)活化，導(dǎo)致細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)尤其是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)下游效應(yīng)遞質(zhì)結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)產(chǎn)生增多，這些細(xì)胞因子能激活HSC，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，合成并分泌大量膠原，同時(shí)由于膠原酶活性降低，膠原降解減少，致使細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與降解失平衡，纖維化形成，進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化。 抑制上述過程中的任

13、一環(huán)節(jié)，均可抑制酒精性肝病的發(fā)展。通過早期應(yīng)用腸道非吸收抗生素選擇性腸道去污染，減輕腸細(xì)菌負(fù)荷和自發(fā)的細(xì)菌污染，可降低血漿內(nèi)毒素水平同時(shí)降低血NO水平，打斷細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而減少循環(huán)中TNF-α、CTGF水平，達(dá)到防止酒精介導(dǎo)的肝損傷及防治酒精性肝病發(fā)生、發(fā)展目的。 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著酒精性肝病的逐漸加重，血清NO也逐漸升高；免疫組化結(jié)果顯示正常大鼠肝組織內(nèi)僅有少量CTGF、TNF-α表達(dá)于匯管區(qū)，隨著酒精性肝病程度的加重

14、，肝組織內(nèi)可見較多CTGF和TNF-α表達(dá)于纖維間隔，且CTGF表達(dá)多于TNF-α的表達(dá)。而早期應(yīng)用腸道非吸收抗生素(阿奇霉素)選擇性腸道去污染，不僅組織學(xué)損傷明顯減輕，而且與炎癥和纖維化有關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)也明顯減少。故在早期應(yīng)用抗生素降低內(nèi)毒素水平，防治酒精性內(nèi)毒素血癥從而防止酒精性肝病的發(fā)生、發(fā)展顯得尤為重要。 結(jié)論 1.長期乙醇慢性刺激對(duì)肝細(xì)胞的損傷隨時(shí)間的推移進(jìn)行性加重，表現(xiàn)為肝臟炎細(xì)胞的浸潤，肝細(xì)胞脂肪變性及