TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠拮抗多次小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的: 胰島β細(xì)胞自身免疫性破壞導(dǎo)致1型糖尿病的發(fā)生，而其增殖能力非常有限，以至于在受到廣泛破壞后不能夠復(fù)制、新生足夠有功能的胰島β細(xì)胞。金屬蛋白酶抑制物-1(Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)作為一種多功能蛋白，可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)活性，調(diào)控多種類型細(xì)胞的增殖、凋亡，以及炎癥反應(yīng)，包括在體外拮抗細(xì)胞因子

2、對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞及細(xì)胞株的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察，給予注射多次小劑量鏈脲佐菌素(multiple low dose streptozotocin，MLDS)后，人TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠(TG)過表達(dá)人TIMP-1對(duì)糖尿病發(fā)生、胰島炎、胰島β細(xì)胞凋亡及增殖的影響；并在NIT-1細(xì)胞中進(jìn)一步驗(yàn)證其促存活及促有絲分裂作用，初步探討了其作用機(jī)制。 方法: 鑒定并檢測(cè)TG小鼠胰腺人TIMP-1表達(dá)，觀察體重、血糖、血清胰島素、糖

3、耐量、胰島素耐量等相關(guān)代謝參數(shù)；給予同周齡、體重匹配的TG小鼠和非轉(zhuǎn)基因(CoN)小鼠鏈脲佐菌素(STZ)40mg·kg<'-1>·d<'-1>連續(xù)5d，觀察小鼠尿量、飲水、攝食量、體重、血糖及死亡率變化，利用蘇木素伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)、胰島素染色、脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick e

4、nd labeling， TUNEL)染色及 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記等組織學(xué)及免疫組織化學(xué)方法評(píng)估胰島炎、胰島細(xì)胞β細(xì)胞凋亡、增殖及胰島β細(xì)胞量的變化。轉(zhuǎn)染并篩選穩(wěn)定表達(dá)人TIMP-1的NIT-1細(xì)胞，通過MTT、Hoechst33342/溴化丙啶(PI)染色、BrdU攝取等方法，以及MMP、P13K及MEK抑制劑的應(yīng)用，Western blot分析Akt、ERK磷酸化水平，驗(yàn)

5、證TIMP-1拮抗STZ對(duì)β細(xì)胞的直接毒性作用，并初步探討了TINIP-1上述作用的機(jī)制。 結(jié)果: (1)尾DNA PCR鑒定TIMP-1轉(zhuǎn)基因小鼠，Northern blot分析表明，TG小鼠可見胰腺人TIMP-1高水平表達(dá)，而Con小鼠未見表達(dá)；相關(guān)代謝指標(biāo)顯示，Con與TG小鼠的空腹血糖、血清胰島素水平、經(jīng)腹腔葡萄糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)均無顯著差異，胰島α細(xì)胞的分布和所占胰島比例也無顯著差異。給予MLDS后，Con

6、小鼠FBG顯著升高，伴有明顯的多尿、多飲、多食、體重減輕及酮癥，低胰島素血癥，并在17周(w)內(nèi)相繼死亡；TG小鼠血糖升高程度相較低(2w：TG，13.0±1.3 mmol/L vs Con，24.5±1.6nzrnol/L，P<0.0001)，胰島素水平雖然也明顯下降，但仍然顯著高于Con小鼠，并且在12w后TG小鼠血糖水平逐漸回落，胰島素水平逐漸回升，大部分TG小鼠(83％)存活下來。組織及免疫組織化學(xué)分析顯示，MLDS處理后Con

7、小鼠約40％胰島出現(xiàn)不同程度的胰島炎(Ⅰ～Ⅳ級(jí))、凋亡胰島細(xì)胞顯著增加及胰島β細(xì)胞量嚴(yán)重丟失；而TG小鼠僅6％左右胰島出現(xiàn)輕度胰島炎(Ⅰ級(jí))，顯著低于Con組(P=0.000)，凋亡胰島細(xì)胞顯著少于Con組(P<0.05)，殘存胰島β細(xì)胞量顯著高于Con組(P<0.05)，并且MLDS處理40 w后，胰島β細(xì)胞量基本恢復(fù)正常；另外，胰島β細(xì)胞增殖評(píng)估顯示，MLDS處理后TG小鼠和Con小鼠胰島細(xì)胞增殖均明顯增加，TG小鼠增加更為顯著(P

8、<0.05)。 (2)G418篩選4 w獲得穩(wěn)定表達(dá)hTIMP-1的NIT-1細(xì)胞；STZ可呈時(shí)間和劑量依賴性的抑制NIT-1細(xì)胞活性，而過表達(dá)TIMP-1可拮抗STZ毒性，降低STZ誘導(dǎo)的NIT-1死亡，增加NIT-1的存活，但PI3K抑制劑LY294002及MEK抑制劑U0126可抵消其保護(hù)作用，MMP抑制劑GM6001、強(qiáng)力霉素均不能拮抗STZ對(duì)NIT-1細(xì)胞的毒性作用。Western blot分析顯示，TIMP-1組Ak