小鼠腭裂相關基因mcpr1功能的研究.pdf

1、目的：本實驗室克隆的小鼠腭裂相關基因1(MouseCleftPalateRelatedgenel，簡稱mcprl)在2002年初被GenBank收錄并命名，其前期研究鑒定了mRNA全長，初步建立了mcprl組織表達圖譜，并探討了這個基因在頜面部發(fā)育中的時空表達，成功構建了mcprl的綠色熒光真核表達載體，制備了mcprl多克隆抗體。但是，對mcprl的功能仍有許多未知之處，在本實驗研究工作中，我們從該基因編碼蛋白MCPRl在小鼠胚胎發(fā)育

2、不同時期的表達變化；亞細胞定位；過表達與抑制表達對小鼠腭突間充質細胞(MEPM)生物學特性的影響；mcprl與維甲酸(RA)的關系等方面對其功能做了初步的分析。為進一步深入地研究該基因的功能和相應蛋白的功能奠定基礎。 方法：①mcprl在小鼠胚胎發(fā)育中的表達研究取妊娠12、14、18天的C57BL/6N近交系孕鼠引頸處死，取出胎鼠，置于40g/L多聚甲醛中4℃固定24h,胎鼠側面部朝下石蠟包埋，制備5μm厚連續(xù)切片。免疫組化檢測

3、，觀察mcprl的蛋白表達情況。②mcprl的亞細胞定位研究取妊娠第12.5天的C57BL/6N孕鼠引頸處死，在75％酒精中浸泡10s，無菌條件下取出胚胎，放在PBS中，在顯微鏡下分離腭突。用組織塊法進行原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，待細胞生長密度接近80％，0.25％胰酶消化，傳代。取第3代的細胞爬片，按免疫組化檢測試劑盒所示程序進行免疫組化染色。以角蛋白、S-100蛋白和波形蛋白多克隆抗體為一抗，鑒定細胞來源。培養(yǎng)5代后用于

4、實驗。提取MEPM細胞胞漿蛋白和胞核蛋白，采用本實驗室制備的mcprl多克隆抗體，應用WesternBlot技術檢測mcprl在胞漿及胞核中的表達以進行MCPR1蛋白的亞細胞定位。③mcprl對腭突間充質細胞生物學特性的影響利用前期實驗構建的pEGFP-N3-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達載體，采用脂質體介導方法，按照invitrogen公司產(chǎn)品說明書的方法用Lipofectamine2000TM將pEGFP-N3

5、-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達載體瞬時轉染到MEPM細胞中，同時設空載體轉染組和空白對照組，MTT法檢測轉染后細胞增殖情況，流式細胞儀分析轉染pEGFP-N3-mcprl及反義pEGFP-N3-mcprl真核表達載體對MEPM細胞周期的影響。④mcprl與RA的關系將成功轉染了pEGFP-mpcrl正義載體和反義pEGFP-mpcrl載體的MEPM細胞72h后傳代入六孔板后，隨機分為RA誘導正義轉染組(A組)、R

6、A誘導反義轉染組(B組)、RA誘導未轉染組(C組)、正常對照組(D組)。各誘導組加入1×10-8mol/L濃度的ATRA(用無水乙醇稀釋)，對照組加入同等劑量的無水乙醇。MTT檢測各組細胞增殖情況；同時用Western-Blot法檢測MCPRl表達情況的改變；流式細胞儀檢測細胞周期變化。 結果：①免疫組化結果顯示MCPRl在小鼠胚胎多組織的發(fā)育中呈現(xiàn)不同的表達模式，在E14時，Meckel軟骨內有少數(shù)MCPRl陽性表達細胞，軟骨

7、周圍陽性細胞較多；在E18，Meckel軟骨內MCPRl陽性表達細胞增多，且前部較后部多。②對提取的MEPM細胞胞漿蛋白和胞核蛋白進行WesternBlot結果顯示在胞漿蛋白中MCPRl陽性條帶明顯，而胞核蛋白中無明顯陽性條帶。③MTT檢測結果顯示反義轉染組MEPM細胞增殖活性明顯高于正義轉染組和空白對照組；流式細胞儀檢測結果顯示反義轉染組MEPM細胞處于S期、G2及M期的細胞比例明顯高于正義組及空白對照組，具有顯著差異。表明反義表達載

8、體轉染后處于DNA合成期及合成后期的細胞顯著增多。④MTT檢測結果顯示B組細胞增殖活性與D組差異無統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測結果顯示B組處于S期、G2及M期的細胞比例與D組無顯著性差異。WesternBlot結果表明mcprl在RA誘導的A組及C組中表達較強，在B組中最弱。 結論：①推測mcprl在顱神經(jīng)嵴細胞成骨過程中可能以促PCD基因的身份在軟骨細胞的移行中發(fā)揮作用；在胚眼發(fā)育中的時空表達變化提示mcprl可能在視泡的形成及

9、晶狀體等眼部結構的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。②WesternBlot結果說明mcprl的蛋白表達產(chǎn)物定位于細胞漿，mcprl蛋白屬胞漿蛋白，與生物信息學預測及前期實驗原位雜交結果及細胞免疫組化染色結果相一致。亞細胞定位的進一步明確，為后續(xù)研究致畸劑如維甲酸作用下MEPM細胞內mcprl的表達變化，以及封閉mcprl后MEPM細胞生物學行為的改變提供實驗依據(jù)。為進一步研究該蛋白的功能打下了堅實的基礎。③通過pEGFP-N3-mcprl及反

10、義pEGFP-N3-mcprl真核表達載體的轉染證明了mcprl的反義真核表達載體可以在蛋白水平有效的封閉mcprl的表達，表明反義真核表達載體封閉效果的可靠性，更為有意義的是顯示了mcprl的表達降低后，細胞的增殖指數(shù)明顯增高，提示mcprl可能通過參與細胞凋亡等負反饋機制調控細胞的生長，從而在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著相應的作用。④轉染了反義pEGFP-N3-mcprl真核表達載體的MEPM細胞在RA誘導的條件其生物學特性未顯著變化，說明